王 佩， 李盛陶， 王 寧， 高曉冬

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

在真核生物中，天冬酰胺（N）連接的糖基化直接影響糖蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，是最重要的翻譯后修飾過程之一[1-2]。 N-聚糖合成是一個高度保守的多步驟反應(yīng)過程，首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上組裝合成一個多萜醇連接的寡糖前體Glc3Man9GlcNAc2-PPDol（DLO）[3]。 13 個稱為Alg 蛋白（天冬酰胺連接的糖基化）的ER 糖基轉(zhuǎn)移酶，催化DLO 的生物合成[4]。 然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，寡糖基轉(zhuǎn)移酶（OST）的作用下將寡糖部分從多萜醇錨定物上轉(zhuǎn)移到新合成蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基上。 之后，寡糖連接的糖蛋白經(jīng)歷晚期ER 和高爾基體的進一步修飾， 包括選擇性去除甘露糖殘基并添加N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、半乳糖、唾液酸和巖藻糖殘基，隨后成熟的寡糖連接的糖蛋白運輸?shù)郊毎砻婊蚍置诘郊毎鈁5]。

N-聚糖的合成以及糖蛋白和糖脂的附著裝配中的遺傳缺陷屬于先天性糖基化疾?。–DG）大家族[6]。 目前已經(jīng)有超過150 種CDG 類型被報道，其中大多數(shù)涉及N-糖基化的缺陷[7-8]。 與CDG 相關(guān)的疾病異常現(xiàn)象幾乎影響每個器官系統(tǒng)[9]。 大多數(shù)CDG 表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，并具有以下特征的廣泛的多系統(tǒng)缺陷，包括神經(jīng)系統(tǒng)缺陷、發(fā)育遲緩、多器官肌張力低下、消化系統(tǒng)異常、腺體功能異常及凝血障礙等[9-11]。

ALG11 位于13 號染色體上并編碼甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外側(cè)以GDP-Man 為底物，將第4 和第5 個Man 轉(zhuǎn)移到DLO 上[12]。ALG11-CDG 源于ALG11 基因的致病變異。 迄今為止，僅12 位患者被確診為ALG11-CDG[13-17]，見表1。ALG11-CDG 病人雖然都呈現(xiàn)廣泛的多系統(tǒng)缺陷，但是不同患者的疾病嚴重程度并不一樣，尤其是存活時間：有些病人很早就死亡；有些病人能存活很多年。 目前對應(yīng)不同ALG11-CDG 突變的患者疾病嚴重程度的測定方法主要是通過酵母回補實驗， 即將CDG 相關(guān)的人Alg11 突變蛋白轉(zhuǎn)入敲除ALG11 基因?qū)е碌臏囟让舾薪湍钢?，觀察酵母生長缺陷及低糖基化的回補情況[10]。但是此方法結(jié)果顯示，酵母生長缺陷的嚴重程度與病人的嚴重程度沒有很好的相關(guān)性，因此需要有一種定量的方法來揭示存在于Alg11 中的不同突變與疾病嚴重程度的相關(guān)性。

表1 ALG11-CDG 病例總結(jié)Table 1 Summary of ALG11-CDG patients

Alg11 的底物DPGn2M3 從動植物組織中提取效率低，且DPGn2M3 結(jié)構(gòu)中多萜醇（Dolichol）的碳鏈較長，導(dǎo)致其合成和純化難度很高。 具有與多萜醇類似結(jié)構(gòu)而碳鏈較短的植烷醇（Phytanol）成為體外合成Alg1/Alg2/Alg11 復(fù)合體底物DPGn2 中脂肪鏈部分的首選。 近年來開發(fā)出的通過化學(xué)法將植烷醇與殼二糖偶聯(lián)合成出PPGn2 的方法， 為研究N-糖基轉(zhuǎn)移酶性質(zhì)開辟了新途徑[18-19]。 作者所在實驗室前期在大腸桿菌中表達了酵母來源的重組蛋白Alg1ΔTM、Trx-Alg2 和Alg11ΔTM， 以PPGn2 為底物，GDP-Man 為糖基供體， 利用化學(xué)酶法快速高效的合成PPGn2M5，該底物合成對體外測定人Alg11突變蛋白活性提供了重要的依據(jù)[20-23]。

作者嘗試在HEK293 和釀酒酵母及大腸桿菌中表達人ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白， 并成功在大腸桿菌中大量表達。 結(jié)合本實驗室開發(fā)的體外重構(gòu)N-糖基化途徑中多萜醇寡糖前體的方法， 測定了ALG11-ODG 相對活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌表達菌株Rosetta DE3 和表達載體pET-28a 質(zhì)粒： 購于德國Novagen公司；人基因組文庫：購于美國Invitrogen 公司；質(zhì)粒pRS426、pME-hyg：釀酒酵母W303a、人體胚胎腎細胞HEK293：均為作者所在實驗室保存，見表2；引物合成及基因測序：由華大基因公司完成。

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌XL10-Gold 使用LB 液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)； 大腸桿菌表達菌株使用TB培養(yǎng)基培養(yǎng)；釀酒酵母使用YPAD 和SD-Ura 培養(yǎng)；人胚胎腎細胞HEK293 在含有10%胎牛血清的DMEM（dulbecco′s modified eagle medium）中培養(yǎng)。

表2 本研究所用表達系統(tǒng)和ALG11-CDG 突變位點Table 2 Expression system and ALG11-CDG mutation sites used in this study

1.1.3 主要試劑 Primer Star GLX DNA 聚合酶、Ligation Mix DNA 連接酶、2× Taq Master Mix 及限制性內(nèi)切酶：購自大連寶生物工程公司；SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠制備試劑盒： 購自碧云天生物；ClarityTM Western ECL Substrate 顯色劑：購自伯樂中國公司；Goat Anti-Mouse IgG HRP、Blue Plus ⅡProtein Marker、1 kb Plus DNA Ladder： 購自北京全式金生物公司；Anti-Flag Mouse mAb、GDP-Man：購自西格瑪奧德里奇（上海） 貿(mào)易有限公司；SanPrep膠回收試劑盒、SanPrep 產(chǎn)物純化試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA 小型抽提試劑盒： 購自生工生物工程公司；DMEM-F12 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）：購自Gibco 公司；其他試劑：均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.1.4 主要儀器 半干電轉(zhuǎn)儀： 購自伯樂中國公司；三重四極桿液質(zhì)連用儀：購自美國賽默飛世爾科技公司； 液相色譜柱粒徑1.7 μm，2.1 mm×100 mm：購自美國沃特世公司；Image QuantTM LAS 4000 mini 顯像儀：購自美國通用電氣公司。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建 在NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載人類ALG11 的基因序列。引入酶切位點XhoⅠ和KpnⅠ，所有 ALG11 點突變引物根據(jù) Agilent 公司QuikChange Primer Design 在線設(shè)計。 以ALG11-Fw和ALG11-Rv（見表3）為引物，以人基因組文庫中包含ALG11 基因的單克隆質(zhì)粒為模板擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用PCR 產(chǎn)物回收試劑盒回收目的片段，經(jīng)XhoⅠ與KpnⅠ雙酶切，載體用相同的體系進行雙酶切， 回收后的片段與載體用ligation mix 連接，轉(zhuǎn)化XL10-Gold 感受態(tài)細胞，涂布于LB固體培養(yǎng)平皿上（含100 μg/mL 的Amp），37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進行菌落PCR 及雙酶切電泳圖譜鑒定，并測序驗證。

表3 本研究所用的引物Table 3 Primers used in this study

1.2.2 蛋白質(zhì)印記法 取制備的蛋白質(zhì)溶液40 μL，加入10 μL 5×SDS 蛋白質(zhì)上樣緩沖液， 混勻后于100 ℃煮10 min。 配制12 g/dL 的分離膠和5 g/dL的濃縮膠。 取5 μL 蛋白質(zhì)樣品上樣， 電壓90 V、30 min，后轉(zhuǎn)為180 V、1 h。 半干法轉(zhuǎn)膜后，5% 脫脂牛奶封閉1 h；一抗Anti-Flag Mouse mAb（1∶3 000），室溫孵育2 h； 二抗Goat Anti-Mouse IgG HRP（1∶5 000），室溫孵育1 h；用ClarityTM Western ECL Substrate 顯 色 液 顯 色，Image QuantTM LAS 4000mini 顯像系統(tǒng)對結(jié)果進行分析。

1.2.3 重組蛋白在人體胚胎腎細胞中表達 首先將細胞接種到6 孔板中，待細胞長到90%時，參照Lipofectamine2000（Invitrogen，USA）的說明書，轉(zhuǎn)染前吸去細胞原有培養(yǎng)基， 加入2 mL 新鮮的完全培養(yǎng)基， 轉(zhuǎn)染時取2 個EP 管，A 管將4 μg pMEALG11-3Flag 野生型及突變體質(zhì)粒溶于250 μL Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基中。 B 管將5 μL lipo2000溶于250 μL Opti -MEM 無血清培養(yǎng)基中， 混勻室溫放置5 min。 將A B 兩管混合，放置20 min，向培養(yǎng)皿加入EP 管中混好的脂質(zhì)體，12 h 后換新鮮培養(yǎng)基，24 h 后用胰酶消化保留一半的細胞，48 h 后收集細胞，用1 mL PBS 洗一遍。 向其中加入60 μL裂解液 （150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.1%SDS，1.5 mmol/L EDTA，1%曲 拉 通，1 mmol/L PMSF），混勻，在冰上靜置30 min 后于15 000 r/min 離心15 min，參照1.2.2 中的方法檢測蛋白質(zhì)表達。

1.2.4 放線菌酮（Cycloheximide） 追蹤實驗 轉(zhuǎn)染24 h 后用潮霉素（hygromycin，Invitrogen，USA）篩選2 周， 并用有限稀釋法 （limiting dilution cloning，LDC）分離單克隆細胞株，由此獲得HEK 293 穩(wěn)定表達Alg11 及突變蛋白的細胞株。 將100 μg/mL 放線菌酮（Cycloheximide）添加到生長狀態(tài)良好的細胞中，并分裝細胞在添加后的指定時間去除。 收集細胞，參照1.2.2 中的方法檢測蛋白質(zhì)表達。

1.2.5 重組蛋白質(zhì)在釀酒酵母中表達 接種W303a 到5 mL YPAD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床過夜振蕩培養(yǎng)至OD660達到1.0 左右，收集菌體，加入100 μL 一步轉(zhuǎn)化液（1 mol/L 二硫蘇糖醇（DTT）10 μL，2 mol/L 醋酸鋰（LiAc） 10 μL，50%聚乙二醇80 μL）及0.5 ～1 μg 帶 有URA3 遺 傳 標 記 的 一 系 列pRS316-TEFpr-ALG11-3Flag 野生型及突變體質(zhì)粒DNA 并振蕩混勻， 將混合液置于金屬浴加熱器中，45 ℃反應(yīng)30 min；反應(yīng)結(jié)束后，涂布于SD-Ura 平板，待單菌落生長到合適大小后，挑取若干單菌落劃線于SD-Ura 平板上，2～3 d 后挑取適量酵母菌接種到SD-Ura 液體培養(yǎng)基中，收集對數(shù)生長期的OD為5 左右的釀酒酵母菌體，加入200 μL 8 mol/L 尿素， 并加入和菌體等體積的玻璃珠（425～600 mm，Sigma-Aldrich），渦旋振蕩1 min，冰上放置1 min，15 個循環(huán)裂解釀酒酵母，釋放細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。 釀酒酵母裂解后于4 ℃下15 000 r/min 高速離心15 min，收集上清液， 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度用BCA 試劑盒測定，參照1.2.1 中的方法檢測蛋白質(zhì)表達。

1.2.6 重組蛋白在大腸桿菌中表達 將pET28a-ALG11 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta DE3 大腸桿菌中得到重組菌。 挑取單菌落接種到5 mL LB 培養(yǎng)基 （含50 μg/mL Kan，34 μg/mL Cm）中，37 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)（約12 h）。按照體積分數(shù)1%接種于新鮮TB 培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)至OD600約0.6 時，將搖瓶移至16 ℃搖床， 取1 mL 菌液作誘導(dǎo)前對照，待培養(yǎng)基溫度降低后添加100 mmol/L IPTG，16 ℃培養(yǎng)16 h。 誘導(dǎo)后取1 mL 菌液作誘導(dǎo)后對照，9 000 r/min、4 ℃離心5 min 收集菌體。 收集10 mL菌體重懸緩沖液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0），將菌體冰浴超聲破碎（超聲2 s，停2 s，持續(xù)2 min）后于4 ℃、4 000 g 離心30 min，棄沉淀，收集上清液。 100 000 g 超速離心60 min，棄上清液， 沉淀重懸于100 μL 緩沖液 （14 mmol/L MES/NaOH，pH 6.0、30%甘油）， 即得到大腸桿菌細胞膜成份。膜成份中總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度用BCA 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測量試劑盒進行測定。 取10 μg 上述制備的含膜成份的蛋白質(zhì)， 參照1.2.1 中的方法檢測蛋白質(zhì)表達。

1.2.7 LC-MS （液質(zhì)聯(lián)用） 定量研究ALG11-CDG相關(guān)突變的活性 Alg11 重組蛋白的活性測量體系標準的反應(yīng)條件如下： 底物受體PPGn2-Man3 （50 μmol/L）、糖基供體GDP-Man（2 mmol/L）和含有人Alg11 重組蛋白的大腸桿菌膜成份（20 mg/mL）于緩沖液（14 mmol/L MES/NaOH，pH 6.0，1 mol/L 蔗糖，4 mmol/L 檸 檬 酸 鉀，0.05% NP -40，10 mmol/L MgCl2）中，反應(yīng)體積60 μL，反應(yīng)在30 ℃下靜止孵育8 h 或12 h 后，加入0.2 mL 濃度為20 mmol/L 的HCl 終止反應(yīng)，并于100 ℃下酸解1 h，釋放糖鏈與脂肪鏈 （Phytanol）。 酸解產(chǎn)物加入1 mL 體積分數(shù)2%的乙腈溶液混勻后，12 000 g 離心1 min，上清液通過1 mL 固相萃取填料Supelclean ENVI-Carb Slurry 進行糖鏈的純化，純化方法參照說明書。 經(jīng)過填料純化的糖鏈于25%的乙腈溶液中洗脫，通過冷凍干燥，最終得到的純化糖鏈粉末溶解于40 μL 的純水中，糖鏈用液質(zhì)聯(lián)用方法進行檢測，液相條件為： 流動相A 乙腈， 流動相B 純水； 梯度：0～2 min，20% B；2～15 min，20%～50% B；15～18 min，50% B；流量：0.2 mL/min，柱溫40 ℃。 質(zhì)譜條件為：正離子模式，檢測范圍m/z 400～1 600。

2 結(jié)果與討論

2.1 ALG11-CDG 突變蛋白在HEK293 中穩(wěn)定性研究

首先在同為哺乳動物細胞的HEK293 中表達ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白。 用抗Flag-tag 抗體對蛋白質(zhì)進行Western blot 驗證， 從蛋白質(zhì)電泳圖中可知， 在50 000～70 000 之間出現(xiàn)一條明顯的蛋白質(zhì)條帶，目的蛋白質(zhì)的理論相對分子質(zhì)量為55 600，相對分子質(zhì)量和預(yù)期的大小一致， 表明蛋白質(zhì)在HEK293 中成功表達，見圖1。由于Flag 標簽加在蛋白質(zhì)C 端，c.623-642del 突變產(chǎn)生的210 個氨基酸的截短蛋白在此處的沒有檢測到。 ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白比Alg11 野生型蛋白表達量顯著減少，不同Alg11-CDG 突變蛋白表達量也各不相同。這說明ALG11-CDG 突變蛋白在HEK293 中是不穩(wěn)定的。

圖1 ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白在HEK293 中的表達及定量分析Fig. 1 Expression and quantitative analysis of ALG11-CDG mutant proteins in HEK293

為了研究是否確實存在ALG11-CDG 蛋白被降解，首先通過CHX 追蹤，分析在HEK293 細胞中過表達的具有C 末端Flag 標簽的Alg11 野生型及ALG11-CDG L86S 突變蛋白的穩(wěn)定性。 L86S 蛋白半衰期約為1 h（圖2（a）），而Alg11 野生型蛋白的半衰期則長達8 h（圖2（b））。 這說明哺乳動物細胞內(nèi)可能存在某種機制， 如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑（ERAD），能夠準確識別降解ALG11-CDG 蛋白，使哺乳動物細胞HEK293 中不能穩(wěn)定表達相應(yīng)蛋白質(zhì)。

圖2 Alg11 蛋白降解追蹤Fig. 2 Degradation curve of Alg11 protein

2.2 ALG11-CDG 突變蛋白在釀酒酵母中穩(wěn)定性研究

ALG11-CDG 突變蛋白在哺乳動物細胞中不穩(wěn)定，我們研究了其在另一真核生物釀酒酵母中的穩(wěn)定性。 Western Blot 結(jié)果表明，Alg11 及Alg11-CDG突變蛋白在釀酒酵母中成功表達， 見圖3。 野生型Alg11 表達量高于6 個突變， 不同突變蛋白表達量也各不相同。 這個結(jié)果說明，釀酒酵母存在哺乳動物細胞類似的降解ALG11-CDG 蛋白的機制， 但是和哺乳動物細胞中并不完全相同， 因此ALG11-CDG 突變蛋白在釀酒酵母中不能穩(wěn)定表達。酵母中ERAD 跟哺乳動物細胞中的不相同， 所以我們看到ALG11-CDG 突變蛋白在這兩種細胞內(nèi)的降解也不相同。

圖3 ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白在釀酒酵母中的表達及定量分析Fig. 3 Expression and quantitative analysis of ALG11-CDG mutant proteins in Saccharomyces cerevisiae

2.3 大腸桿菌中ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白穩(wěn)定表達

原核細胞沒有真核細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑，因此在原核細胞大腸桿菌中表達ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白。 蛋白質(zhì)電泳結(jié)果表明，ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白在大腸桿菌中成功表達。 其中6 個突變的表達量和野生型基本一致，見圖4。 c.623-642del 突變的上樣量只有其它突變的1/10，因此該突變跟其它的突變相比表達量極高， 這說明ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白成功在大腸桿菌中穩(wěn)定表達。

2.4 LC-MS 定量分析ALG11-CDG 相關(guān)突變的活性

大腸桿菌中穩(wěn)定表達的突變和野生型蛋白可進行定量活性比較。 測量它們的活性時，加入反應(yīng)的總蛋白質(zhì)量一致。反應(yīng)12 h 后，通過LC-MS 進行檢測，結(jié)果見圖5。c.623-642del 和E398K 完全沒有活性；L86S 活性顯著降低（UPLC 圖很難看到明顯的產(chǎn)物峰， 但ESI-MS 顯示在13.7 min 和14.7 min 附近分別有中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量產(chǎn)物；G160V 活性也很低；Q318P 活性降低一般；Y279S和L381S 活性相對于野生型降低很少。

雙功能酶Alg11 催化的是兩個相同糖苷鍵的Man （α-1，2）， 因此推測兩步反應(yīng)的Km值差別不大，從而反應(yīng)中很少有中間產(chǎn)物的積累，實驗可以通過終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率來定量Alg11 的活性。 定義ALG11-CDG 相關(guān)的突變蛋白的相對活性為： 突變Alg11 的轉(zhuǎn)化率/野生型Alg11 的轉(zhuǎn)化率。 表4 為定量分析7 個突變蛋白的相對活性：病人1（同合子突變L86S）在2 歲時死亡，L86S 突變蛋白只有1.8%野生型的活性，與病人嚴重的癥狀相吻合；病人2 為病人1 的弟弟， 后面的臨床癥狀沒有報道； 病人3（雜合子突變c.623-642del 和Y279S） 目前7 歲，雖然c.623-642del 沒有活性，但是Y279S 突變蛋白仍有83.8%野生型的活性，與病人溫和的癥狀相吻合；病人4（雜合子突變E398K 和L381S）目前4.5 歲，雖然E398K 沒有活性， 但是L381S 突變蛋白仍有83.8%野生型的活性，與病人溫和的癥狀相吻合；病人5（同合子突變Q318P）目前8.5 歲，Q318P 突變蛋白仍有38.8%野生型的活性， 與病人溫和的癥狀相吻合；病人6（雜合子突變c.36dupG 和G160V）在4個月時死亡，c.36dupG 沒有活性，且G160V 突變蛋白只有5.8%野生型的活性，與病人嚴重的癥狀相吻合；病人7（雜合子突變c.45-2A>T 和G160V）在3歲時死亡，c.45-2A>T 可能沒有活性， 且G160V 活性極低，定量檢測活性的方法顯示，ALG11-CDG 相關(guān)突變的活性下降程度與疾病的嚴重程度具有一定的相關(guān)性。

圖4 ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白在大腸桿菌中的表達Fig. 4 Expression of ALG11-CDG mutant proteins in E.coli

圖5 LC-MS 定量分析ALG11-CDG 相關(guān)突變的活性Fig. 5 Quantitative analysis of the activity of ALG11-CDG mutations using LC-MS

3 結(jié) 語

首先在哺乳動物細胞HEK293 和低等真核細胞釀酒酵母中表達ALG11-CDG 相關(guān)突變蛋白，發(fā)現(xiàn)突變蛋白表達量低于野生型Alg11 蛋白， 不同突變蛋白表達量均有顯著差異， 這表明ALG11-CDG突變蛋白不能在真核細胞中穩(wěn)定表達， 考慮到Alg11 為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白， 其降解有可能通過ERAD（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解）途徑的控制。 而在沒有ERAD 途徑的原核細胞大腸桿菌中，Alg11 野生型及突變蛋白得到了穩(wěn)定表達。 這一結(jié)果有力地支持CDG 突變蛋白通過ERAD 途徑被降解的推測。 與此同時，我們的LC-MS 定量分析ALG11-CDG 蛋白活性的結(jié)果也證明了ALG11-CDG 突變蛋白的相對活性與疾病的嚴重程度存在一定的相關(guān)性。 因此，大腸桿菌表達的方法可以用于CDG 患者疾病嚴重程度的預(yù)測。 CDG 突變所造成的Alg11 的酶活性與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)聯(lián)及有關(guān)分子機制有待進一步闡明。

表4 ALG11-CDG 相關(guān)突變的相對活性總結(jié)Table 4 Summary of relative activity of mutations in ALG11-CDG patients