李 琦， 童欣怡， 姜云鵬， 蔣玉潔， 李冬冬， 趙林果

（1. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210037；2. 南京林業(yè)大學 化學工程學院，江蘇 南京210037）

β-木糖苷酶（1，4-β-D-xylan xylohydrolase，EC 3.2.1.37）常與內切木聚糖酶聯(lián)用，降解富含木聚糖的農林植物纖維原料，繼而將木糖開發(fā)成可用于燃料、食品等行業(yè)中的系列化學品[1-2]。 此外，β-木糖苷酶也被越來越多地應用于植物資源中帶有木糖基的天然活性物質（如萜類、黃酮類、甾體類化合物）的生物轉化，進而獲得更強藥理活性的天然產物衍生物[3-5]。 無論是木聚糖的降解還是天然活性物質的生物轉化，獲得活性高、專一性強、酶學性質優(yōu)異的β-木糖苷酶是關鍵的技術。

近年來，學者們已就β-木糖苷酶的來源、優(yōu)良菌種的篩選、基因克隆和表達等方面進行了大量的深入研究[6-7]。 然而，現(xiàn)有的β-木糖苷酶仍存在著含量少、酶活低、穩(wěn)定性差、底物特異性不佳等缺點，遠不能滿足工業(yè)應用的需求。 隨著現(xiàn)代生物技術的不斷革新，酶分子的體外定向進化技術已成為蛋白酶分子改造的有力工具[8]。 周海巖等[9]利用定點飽和突變技術將L-脯氨酸-4-羥化酶（P4H）的酶活提高了58%。 秦海彬等[10]在α-酮戊二酸半醛脫氫酶E120 位點處引入了天冬氨酸后， 酶活提高了322%。 蔡劉滕子等[11]利用定點突變技術對黑曲霉來源的木聚糖酶進行熱穩(wěn)定性改造，突變酶的最適溫度提高了5 ℃，45 ℃下的半衰期由7 min 提高到15 min。李琦等[12]通過定點突變技術在木聚糖酶MxynB的相應位置引入二硫鍵， 并通過基因融合技術在N端融合了來源于嗜熱菌的纖維素結合域CBD，使原酶的溫度穩(wěn)定性顯著提高。

由于嗜熱菌D. thermophilum 來源的β-木糖苷酶Xln-DT[13]在大腸桿菌中的表達量較低，筆者通過蛋白質結構模擬和分子對接等手段確定了β-木糖苷酶Xln-DT 可突變的位點。 利用反向PCR 技術擴增突變基因、 構建重組表達載體并獲得突變酶，并對比分析了突變前后的酶學性質， 旨在獲得酶活高、耐熱性能強的優(yōu)勢突變酶，為后續(xù)的實際應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種和質粒

大 腸 桿 菌Escherichia coli Top10F′ 、 E.coli BL21（DE3）和重組質粒pET28a-xln-DT：均由南京林業(yè)大學化學工程學院微生物技術研究室保藏；表達質粒pET28a（卡那霉素（kana）抗性）：購自美國Novagen 公司。

1.2 培養(yǎng)基

Lysogeny broth（ LB）培養(yǎng)基：蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、NaCl 1 g，溶于100 mL 蒸餾水中，121℃滅菌20 min 后備用，主要用于大腸桿菌菌種的活化及重組基因工程菌株的誘導表達。LB 固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基中加入質量分數(shù)2%的瓊脂。

1.3 酶和化學試劑

Prime STAR HS DNA 聚 合 酶、T4 DNA 磷 酸 化激酶、T4 DNA 連接酶、dNTP、DL 5 000 DNA Marker等：購自日本TaKaRa 公司；蛋白質相對分子質量標準Marker： 購自美國Promega 公司； 質粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、卡那霉素等：購自美國Axygen公司；胰蛋白胨、酵母提取物：購自英國Oxoid 公司；對硝基苯基-β-L-木糖苷（p NPX）：購自美國Sigma公司；其它常規(guī)試劑均為國產分析純。 引物合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 主要儀器

PCR 儀：德國Eppendorf 公司產品；5415R 臺式高速冷凍離心機、SX-500 全自動高溫高壓蒸汽滅菌鍋：日本Tomy 產品；凝膠成像儀：美國Bio-rad 公司產品；ZHWY-2102C 搖床： 上海智誠產品；SpectraMax190 全波長酶標儀： 美國Molecular Devices 公司產品。

1.5 蛋白質三維結構的預測和相關軟件

利用分子生物學軟件DNAMAN 6.0 進行氨基酸序列分析并進行Blast 比對。 利用PyMOL、Swiss Model 和I-TASSER Server 軟件進行Xln-DT 蛋白結構模擬和活性催化中心預測。

基于I-TASSER Server 對Xln-DT 蛋白結構進行 預測[14]，在I-TASSER Server 在線網(wǎng)站（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）上輸入β-木糖苷酶Xln-DT 的氨基酸序列， 得到蛋白質的三維預測結果及配體結合位點的具體信息。

1.6 酶與底物的分子對接

從Pubchem 下載p NPX 分子2D 結構[15]，并以Sdf 格式保存，使用Schrodinger 2015 對p NPX 和β-木糖苷酶Xln-DT 的蛋白質結構進行預處理， 并使用Glide 6.6[16]在該蛋白質的配體結合位點處準備晶格文件，根據(jù)1.5 中獲得的配體結合位點，將晶格中心坐標設置為x：80.92，y：91.18，z：82.72， 配體對接框長度2.0 nm，蛋白質的范德華半徑比例因子設為0.8，絕對部分電荷的截斷值設為0.15。 最后將預處理好的小分子p NPX 在晶格文件中進行對接， 軟件運行后獲得優(yōu)化的預測對接構象。

1.7 氨基酸親和性提高突變位點預測

基于分子對接的結果， 使用BioLuminate 1.8[17]對p NPX 周圍的氨基酸（活性口袋處的氨基酸）進行飽和突變，計算突變前后的親和力變化，具體原理見圖1。根據(jù)突變能由高到低排序，挑選出突變能排序靠前的突變位點進行后續(xù)突變實驗。 計算時，將突變的氨基酸看作配體，余下的所有氨基酸看作受體。 在此情況下，親和力的改變可以用突變能ΔΔG（bind）來表征，該數(shù)值的負值代表著突變體比母體對小分子結合的更緊密。 具體計算公式為：

式（1）中，ΔG1為非突變體自由能變化，kJ/mol；ΔG2為 突 變 體 自 由 能 變 化，kJ/mol；ΔG3為BioLuminate 1.8 軟件計算得出的非突變體和突變體之間的自由能變化，kJ/mol；ΔG4為BioLuminate 1.8 軟件計算得出的結合配體后非突變和突變體之間的自由能變化，kJ/mol。

圖1 蛋白質親和力改變的突變能計算原理圖Fig. 1 Schematic diagram of mutation energy calculation for protein affinity change

1.8 實驗方法

1.8.1 定點突變引物設計 利用同源建模、生物信息學分析、分子對接等手段，改變β-木糖苷酶Xln-DT 的部分氨基酸， 設計突變位點， 以嗜熱菌D. thermophilum DSM 3960 的GH39 家族的β-木糖苷酶基因序列xln-DT 為模板， 設計帶有酶切位點的引物，每個突變位點設計正反向兩條寡核苷酸序列，見表1。 利用反向PCR 技術獲得突變序列。

表1 定點突變引物表Table 1 Nucleotide sequences of used primers

1.8.2 定點突變實驗方案 將上、 下游引物用TE緩沖溶液稀釋成10 μmol/L 工作液，以pET28a-xln-DT 為模板， 利用反向PCR 技術獲得重組突變表達質粒。

PCR 反應體系如下：0.5 μL pET28a-xln-DT，各1.0 μL 的引物F 和引物R，4.0 μL dNTP Mixture，10.0 μL 5×PS 緩沖液，0.5 μL Prime STAR HS DNA聚合酶，44 μL 蒸餾水。

PCR 反應條件如下：98 ℃保溫5 min，98 ℃變性0.5 min，60 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸4.5 min，18個循環(huán)，72 ℃延伸10 min 后于4 ℃保持。 將擴增后PCR 片段于37 ℃下磷酸化反應1 h， 加入1 μL T4 ligase 連接酶，于16 ℃下連接3 h 后在42 ℃水浴鍋中熱擊轉化至大腸桿菌E.coli Top 10F′感受態(tài)細胞中，挑取單菌落接入到含有Kana 抗性的LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質粒后進行測序鑒定。

1.9 突變酶的酶活測定、純化及SDS-PAGE 分析

將測序正確的重組表達質粒pET-28a-xln-DT-161、pET-28a-xln-DT-167、pET-28a-xln-DT-202 和pET-28a-xln-DT-231 熱擊轉化至大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中。 挑取單菌落至5 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中， 加入0.01 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）過夜誘導表達后離心，沉淀加入檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）重懸，經(jīng)超聲破碎后離心10 min，上清液即為粗酶液。將收集的粗酶液進行酶活測定，以pNPX 為底物，根據(jù)文獻[18]進行酶活測定。酶活定義如下：75 ℃、pH 6.0 時每分鐘產生摩爾質量為1 mmol 對硝基苯酚所需的酶量為1 個酶活單位。

酶的純化方式如下：Ni2+親核層析柱平衡后，將粗酶液以1 mL/min 上樣，將25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液以同流速洗去未吸附的酶蛋白及雜質； 隨后用200 mmol/L 的咪唑緩沖液進行洗脫， 并收集蛋白質；純化后的酶液經(jīng)透析除鹽后進行SDS-PAGE 分析。 目的蛋白質采用Bradford 法進行蛋白質濃度的測定。 酶活（A）以及比酶活（B）的計算公式如下：

式中：c 為由對硝基苯酚標準方程計算出的酶反應后的對硝基苯酚的量，μmol；t 為酶與底物反應時間，min；V1為反應體系總體積，mL；V2為酶液體積，mL；N 為酶液稀釋倍數(shù)；C 為蛋白質質量濃度，mg/mL。

1.10 突變酶的酶學性質分析

最適溫度： 在pH 6.0 的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中，分別測定突變酶和Xln-DT 在65、70、75、80、85℃下的酶活， 以測定的最高酶活為100%計算相對酶活，最高酶活對應的溫度即為最適溫度。

最適pH：在各自的最適溫度下，分別測定突變酶和Xln-DT 在pH 值為4.5、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 下的酶活，以測定的最高酶活為100%計算相對酶活，最高酶活對應的pH 即為最適pH。

溫度穩(wěn)定性： 將酶質量濃度分別為1.10、1.25、1.29、1.09 mg/mL 的野生型酶Xln-DT、突變酶Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU、Xln-DT-167ALA 在75、85 ℃下分別保溫30、60、90、120、180、240 min，以未育溫的酶液所測定的酶活為100%計算剩余酶活力，即為溫度穩(wěn)定性。

pH 穩(wěn)定性：在4 ℃下，分別將突變酶和Xln-DT置于不同pH 值（4.0～7.0）的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中保存24 h， 在最適溫度及最適pH 下測定其殘余酶活力， 以未經(jīng)pH 緩沖液處理的酶液所測定的酶活為相對100%，即為pH 穩(wěn)定性。

耐木糖系數(shù)Ki：在添加不同濃度木糖的反應體系中，在最適溫度和pH 下測定突變酶和Xln-DT 的酶活力值，以不加糖所測的酶活力值為100%，計算并獲得不同木糖濃度下重組酶的相對酶活力值，以相對酶活力值為50%時所對應的木糖濃度即為Ki。

動力學常數(shù)：以p NPX 為底物，底物濃度范圍為0.01～3.00 mmol/L， 分別測定純化后的突變酶和Xln-DT 的酶活。采用雙倒數(shù)作圖法[19]計算突變酶和Xln-DT 的動力學參數(shù)（Vmax，Km，Vmax/ Km）。

2 結果與討論

2.1 突變位點的選擇

由于嗜熱菌D. thermophilum 來源的Xln-DT蛋白結構尚未解析，基于PDB 在線數(shù)據(jù)庫中來源于Thermoanaerobacterium saccharolyticum 的GH 39 家族的β-木糖苷酶XynB （1UHV）[20]與Xln-DT 具有70.18%的同源性。 利用Swiss-Model 在線軟件對Xln-DT 進行同源建模，使用可視化工具PyMOL 對Xln-DT 進行結構模擬，結果見圖2。 利用Glide 6.6軟件對人工底物p NPX 與β-木糖苷酶Xln-DT 進行分子對接，計算篩選出3 個正相關的關鍵突變位點（GLU161、CYS202 和TYR231） 和1 個陰性對照位點（PHE167），見表2。

圖2 β-木糖苷酶Xln-DT 的分子模型Fig. 2 Molecular model of Xln-DT

表2 Xln-DT 突變能計算Table 2 Calculation of Xln-DT mutation energy (binding)

2.2 突變體重組表達質粒的構建和表達

以重組表達質粒pET-28a-Xln-DT 為模板，通過反向PCR 引入6 個位點的氨基酸基因，經(jīng)測序驗證所有點突變編碼正確。 將突變正確的質粒轉化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，隨機挑取轉化子進行誘導表達，誘導表達結果見圖3。 當GLU161 突變成HIS 和LEU、TYR231 突變成TRP 之后， 酶活喪失， 而CYS202 突變成PHE 和LEU 后酶活分別提高了3.28 和2.97 倍， 而PHE167 突變成ALA 之后酶活降低了50%。 結合表2 中突變能的預測數(shù)值可知， 除去經(jīng)試驗驗證的酶活喪失的陰性突變體GLU161HIS、TYR231TRP、GLU161LEU 外， 突變體CYS202PHE、CYS202LEU、PHE167ALA 的ΔΔG 逐次升高，分別為-1.22、-1.15、1.33，而實驗結果顯示這3 個突變體表達的酶活則依次降低，由此可見ΔΔG 的數(shù)值為負值且數(shù)值越小，突變體比野生型原酶對小分子的結合越緊密，理論上較野生型原酶的親和力就越強，從而可通過提高突變體的比酶活來提高表達的酶活力。 因此，為了驗證此猜想，作者對各突變體及野生型原酶進行了純化，以比較其比酶活、動力學參數(shù)等。

圖3 酶活提高關鍵位點突變后的酶活Fig. 3 Enzyme activity after mutation of key site for enzyme activity improvement

收集發(fā)酵后的Xln-DT 及突變體經(jīng)鎳柱純化后， 獲得電泳純的Xln-DT、Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU 和Xln-DT-167ALA 多位點突變體，見圖4。 將純化后的Xln-DT 和突變體分別測定蛋白質質量濃度和比酶活，其中，CYS202 突變成PHE 和LEU 后，比酶活分別提高了2.86 和2.54 倍，由此可知，202 位點為酶活提高的關鍵氨基酸位點。

圖4 重組酶Xln-DT 及突變體的蛋白質電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE of recombinant protein Xln-DT and 202/167 mutants

2.3 突變體的酶學性質研究

2.3.1 突變體的最適溫度和最適pH 突變體酶和Xln-DT 的最適溫度見圖5（a）。 Xln-DT 的最適溫度為75 ℃， 突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-167ALA 的最適溫度維持不變，而Xln-DT-202LEU則升高至80 ℃。

突變體酶和Xln-DT 的最適pH 見圖5（b）。Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的最適pH 由原酶的6.0 分別下降至4.5 和5.0， 而Xln-DT-167ALA 則降為5.0。

圖5 202/167 突變體的最適溫度和最適pHFig. 5 Optimal temperature and p H values of 202/167 mutants

2.3.2 突變體的溫度穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性 對突變體酶和Xln-DT 在75、85 ℃下的熱穩(wěn)定性進行研究，結果見圖6。突變體Xln-DT-202PHE 在75 ℃下的溫度穩(wěn)定性有顯著提高，保溫2 h 后，剩余酶活力仍能保持100%。 而突變體Xln-DT-167ALA 在75、85 ℃下的溫度穩(wěn)定性均有明顯下降。 由圖1 可知，配體的自由能不變， 所以當突變體的△△G 為負值時，可理解為突變酶蛋白質的自由能均小于野生型酶蛋白的自由能，而自由能越小酶越穩(wěn)定，因此表現(xiàn)為突變酶的熱穩(wěn)定性提高。

圖6 202/167 突變體的溫度穩(wěn)定性Fig. 6 Temperature stability of mutants 202/167

突變體酶和Xln-DT 的pH 穩(wěn)定性結果見圖7。突變體Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU 和Xln-DT-167ALA 在pH 值為4.0～7.0 的范圍內穩(wěn)定性較原酶略有下降，但仍能保持80%以上的相對酶活力。

圖7 202/167 突變體的p H 穩(wěn)定性Fig. 7 pH stability of 202/167 mutants

2.3.3 突變體的耐糖系數(shù)Ki和動力學參數(shù) 將純化后的Xln-DT 和突變體Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU、Xln-DT-167ALA 分別測定耐糖系數(shù)Ki和動力學常數(shù)，結果見表3。 其中，突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的Km值較原酶Xln-DT 相比下降明顯，說明其對p NPX 的親和力提高了，這與預測的△△G 結果一致，見表2。 突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 突變后△△G為負值，對配體的親和力更強；突變后的Ki系數(shù)顯著降低，由原酶的3 394 mmol/L 降低到249 mmol/L和592 mmol/L， 但仍要高于已報道的β-木糖苷酶，尤其是GH 3 家族來源的β-木糖苷酶[18]。 而突變體Xln-DT-167ALA 動力學常數(shù)Km、Vmax變化不大，耐糖系數(shù)Ki則下降至1 023 mmol/L。

表3 202/167 突變體耐糖系數(shù)和動力學參數(shù)Table 3 Xylose tolerance coefficient and kinetic parameters of 202/167 mutants

3 結 語

以來源于D. thermophilum 的β-木糖苷酶Xln-DT 為研究對象，通過分子對接、定點突變和酶學性質分析等手段， 對Xln-DT 的酶活提高關鍵位點進行研究，主要結論如下：

1） 利用I-TASSER Server 在線軟件對Xln-DT進行蛋白質結構預測， 利用p NPX 與Xln-DT 分子對接計算篩選出基于酶活提高的關鍵氨基酸位點202， 并獲得突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU。

2）與Xln-DT 相比，突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的酶活分別提高了3.28 和2.97倍，比酶活分別提高了2.86 和2.54 倍。Km值也較原酶小， 說明突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 對p NPX 的親和力提高， 但突變后的Ki系數(shù)顯著降低。

3）與Xln-DT 相比，突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的最適溫度維持不變；最適pH 則下降明顯。 突變體Xln-DT-202LEU 的溫度穩(wěn)定性有顯著提高； 而所有突變體的pH 穩(wěn)定性均有不同程度下降，但仍能保持80%以上的相對酶活力。

研究結果不但顯著提高了酶的活力，而且熱穩(wěn)定性也得到顯著改善，從而為該酶的進一步改造和實際應用奠定了基礎。