何貴新 肖婷 秦偉彬 譚煒 林琳 任加以 陳天宇 吳凱 玉黎燕

急性心肌梗死是發(fā)病率、致死率很高的疾病之一，急診冠脈介入術(shù)的推廣使得急性心肌梗死的死亡率大幅下降。但存活患者的心功能無(wú)法恢復(fù)正常。干細(xì)胞治療的出現(xiàn)為急性心肌梗死的治療帶來(lái)新的希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)，具有在體外分化為心肌細(xì)胞的潛力，因此移植干細(xì)胞的最初設(shè)想是它們能夠在體內(nèi)分化成為有收縮功能的心肌細(xì)胞，以代替損失的心肌細(xì)胞，進(jìn)而恢復(fù)心臟收縮功能、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)[1]。盡管干細(xì)胞具有向心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛力，但由于移植入梗死區(qū)存活的干細(xì)胞數(shù)量極少，其分化的效率和存活率均很低，因此限制了干細(xì)胞對(duì)于心肌梗死的治療效果[2]。

近些年來(lái)，中藥的心肌保護(hù)作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。芪參益氣滴丸的四種主要成分為黃芪、丹參、三七、降香，其主要活性成分包括黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、人參皂苷Rg1、丹參酮ⅡA等，這些成分具有抑制細(xì)胞凋亡，維持正常能量代謝、抗炎、清除氧自由基等多種藥理作用[3-5]。心肌梗死后的局部微環(huán)境是非常惡劣的，能影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后的歸巢和存活，同時(shí)梗死心肌局部的炎癥反應(yīng)也阻礙了移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活和分化。既往的研究發(fā)現(xiàn)單一的干預(yù)措施難以成功，而多途徑、多靶點(diǎn)的方法能優(yōu)化干細(xì)胞的移植效率。鑒于芪參益氣滴丸具有上述多靶點(diǎn)多效應(yīng)的作用，課題組提出假說(shuō)：芪參益氣滴丸可以顯著改善心肌梗死后局部組織微環(huán)境，提高移植入梗死區(qū)干細(xì)胞的存活，從而起到優(yōu)化干細(xì)胞移植效力，改善心功能的作用。此研究通過(guò)運(yùn)用小鼠心肌梗死模型，評(píng)估芪參益氣滴丸對(duì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死的優(yōu)化價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生機(jī)構(gòu)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和應(yīng)用指南》(NIH Publication NO.85-23，1996年修訂)相關(guān)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)所采用的動(dòng)物均為C57BL/6雄性，SPF級(jí)，8周齡小鼠，均購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)兩周后行本部分實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥物

芪參益氣滴丸：黃芪、丹參、三七、降香油，天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：180615，每袋裝0.5 g。

1.3 主要儀器與試劑

小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)、小動(dòng)物體表心電圖(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)、氣體麻醉系統(tǒng)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)、可拍照光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)、倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)、普通光學(xué)顯微鏡(上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司)，一抗Rabbit anti-CD3、anti-Ki67(Abcam公司)。二抗：Alexa Flour?594 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG (H+L，Invitrogen)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Goat anti-Rabbit IgG (H+L，北京中杉金橋)、DAPI(Invitrogen)、TUNEL試劑盒(Roche)、Trinton X-100(Sigma)。

1.4 分組及給藥

隨機(jī)將小鼠分為PBS組、干細(xì)胞組和干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸組，每組20只實(shí)驗(yàn)小鼠。造模前10天開(kāi)始灌胃，直至處死。干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸組予芪參益氣滴丸溶液(3.9 mg/mL，飲用水溶解)灌胃，PBS組和干細(xì)胞組予等量飲用水灌胃，每次灌胃0.1 mL/天。

1.5 小鼠心肌梗死模型及干細(xì)胞移植

造模前分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，計(jì)數(shù)后PBS重懸，細(xì)胞密度為2.5×107個(gè)/mL，置冰上，轉(zhuǎn)移至動(dòng)物手術(shù)室內(nèi)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用開(kāi)胸結(jié)扎前降支的方法建立小鼠心肌梗死模型。10%水合氯醛腹腔注射，充分麻醉后將小鼠仰臥位固定于小鼠固定板上，脫毛膏脫去胸前及頸部毛發(fā)，消毒后縱向切開(kāi)頸部皮膚，鈍性分離至氣管，可視下行氣管插管術(shù)，接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，參數(shù)為頻率110 bpm，吸呼比1∶1.2，潮氣量1.8 mL。沿肋骨走形方向，切開(kāi)胸骨左緣第三、四肋間隙的皮膚，鈍性分離胸大肌，暴露肋間隙，眼科剪小心剪開(kāi)肋間肌肉，開(kāi)胸器撐開(kāi)肋骨暴露心臟。眼科鑷子輕輕撕開(kāi)心包膜，充分暴露左心耳。在左心耳下緣2 mm左右，用7-0帶針絲線(xiàn)垂直于冠脈走行方向，從冠脈下方的心肌內(nèi)穿過(guò)并結(jié)扎。體表心電圖提示ST段抬高，并可見(jiàn)左心室前壁心肌變白，室壁運(yùn)動(dòng)減弱，提示結(jié)扎位置正確，建立心肌梗死模型成功。

使用30 G的進(jìn)樣針(Hamilton)抽取20 μL干細(xì)胞懸液(約5×105個(gè))，在梗死區(qū)和梗死周?chē)鷧^(qū)取四個(gè)點(diǎn)均勻注射，每個(gè)點(diǎn)注射5 μL。PBS組抽取20 μL PBS，注射方法相同。注射完畢用無(wú)菌棉球按壓數(shù)秒。然后用4-0絲線(xiàn)逐層縫合肋間隙、胸大肌以及皮膚。待小鼠恢復(fù)自主呼吸后，撤出呼吸機(jī)保留氣管導(dǎo)管，意識(shí)清醒后拔除氣管導(dǎo)管。

1.6 觀(guān)察指標(biāo)

1.6.1 血管新生觀(guān)察 觀(guān)察三周后處死實(shí)驗(yàn)小鼠，留取心臟標(biāo)本。4%多聚甲醛固定24小時(shí)之后，棄去固定液，沿心尖段、中段和心底段三個(gè)橫截面將心臟切成三段，室溫下脫水，透明，浸蠟，包埋，包埋蠟塊時(shí)從心底部至尖切成2段包埋，每組8個(gè)蠟塊，每個(gè)蠟塊至少制作3張切片(6個(gè)切面)。脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)：將浸泡在10 mM pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中玻片加熱，使之維持在95～99℃，10分鐘，取出、自然冷卻30分鐘，PBS潤(rùn)洗5分鐘×2次，3%H202中孵育10分鐘，加入稀釋的二抗，37℃孵育60分鐘。加入DAB顯色，在顯微鏡下觀(guān)察染色進(jìn)展，一旦切片染色成功，立刻將玻片浸入水中終止顯色。為了觀(guān)察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸移植是否能影響梗死區(qū)和邊緣區(qū)的血管新生，行免疫組織化學(xué)染色，anti-CD31用于標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1.6.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 切片脫蠟、水化同上，使用蛋白酶K(10～20 μg/mL)在21-37孵育15～30分鐘，PBS潤(rùn)洗5分鐘×3次。準(zhǔn)備TUNEL混合液：50微升酶溶液+450微升稀釋液，將TUNEL混合液加至組織切片上，完全覆蓋，37℃避光孵育60分鐘，加入DAB顯色，在熒光顯微鏡觀(guān)察GFP熒光蛋白，將切片泡在蘇木精溶液中復(fù)染，切片用蒸餾水洗5分鐘×3次，風(fēng)干后，中性樹(shù)膠封片。為了觀(guān)察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸移植是否能影響梗死區(qū)(infarcted area)和邊緣區(qū)(border zone)的細(xì)胞凋亡，病理切片行免疫組織化學(xué)染色，TUNEL assay被用于標(biāo)記凋亡細(xì)胞。通過(guò)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)第21天時(shí)TUNEL+與GFP+重疊的細(xì)胞數(shù)，評(píng)價(jià)移植后MSCs在心肌中的凋亡情況，定量評(píng)價(jià)芪參益氣滴丸對(duì)移植后MSCs凋亡的影響。

1.6.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) 為了觀(guān)察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸移植對(duì)梗死區(qū)和邊緣區(qū)細(xì)胞增殖的影響，病理切片行免疫組織化學(xué)染色，anti-Ki67被用于標(biāo)記增殖細(xì)胞。每個(gè)切面隨機(jī)選取6個(gè)不同的視野拍照分析，同時(shí)，每個(gè)蠟塊樣本隨機(jī)選取一張切片，選取6個(gè)不同的視野，采用LEICA Qwin V3 圖像分析系統(tǒng)，分析單位心肌面積內(nèi)血管密度, 進(jìn)行小鼠心肌梗死區(qū)、邊緣區(qū)微血管密度定量分析，計(jì)算小鼠心肌單位面積內(nèi)微血管的密度。并且對(duì)梗死區(qū)和邊緣區(qū)Ki67陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸移植對(duì)心肌梗死小鼠血管新生的影響

對(duì)梗死區(qū)微血管密度定量分析，結(jié)果顯示：PBS組與干細(xì)胞組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)；與PBS組相比，干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸組微血管密度明顯增加(P<0.001)；但與干細(xì)胞組相比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明與注射PBS相比，移植MSCs能明顯促進(jìn)梗死區(qū)的血管新生。

對(duì)邊緣區(qū)的微血管密度進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示：PBS組與干細(xì)胞組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；與PBS組和干細(xì)胞組相比，干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸組的微血管密度顯著增多(P<0.01和0.05)，說(shuō)明與注射PBS相比，移植MSCs能促進(jìn)邊緣區(qū)的血管新生，芪參益氣滴丸聯(lián)合移植MSCs能進(jìn)一步增加邊緣區(qū)的微血管數(shù)量。見(jiàn)表1。

表1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸移植 對(duì)心肌梗死小鼠微血管密度定量分析

2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸移植對(duì)梗死小鼠細(xì)胞增殖的影響

對(duì)梗死區(qū)Ki67陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示： PBS組與干細(xì)胞組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P< 0.01)；與PBS組和干細(xì)胞組相比，干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸組的細(xì)胞增殖明顯活躍(P< 0.001和0.05)。

對(duì)邊緣區(qū)Ki67陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示： PBS組與干細(xì)胞組組件比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P< 0.01)；與PBS組相比，干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸組Ki67陽(yáng)性的細(xì)胞顯著增多(P<0.001)，說(shuō)明與注射PBS相比，移植MSCs能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，芪參益氣滴丸聯(lián)合移植MSCs能進(jìn)一步促進(jìn)梗死區(qū)和邊緣區(qū)的細(xì)胞增殖。見(jiàn)表2。

2.3 芪參益氣滴丸對(duì)移植后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響

干細(xì)胞組共計(jì)數(shù)4406個(gè)GFP+細(xì)胞，其中TUNEL+細(xì)胞共2300個(gè)，占52.20%；干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸組共計(jì)數(shù)6059個(gè)GFP+細(xì)胞，其中TUNEL+細(xì)胞共2174個(gè)，占35.88%。組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明芪參益氣滴丸能抑制MSCs移植后凋亡的發(fā)生。見(jiàn)表3。

表2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸移植 對(duì)梗死小鼠細(xì)胞增殖的影響

表3 芪參益氣滴丸對(duì)移植后 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響(n=10)

2.4 芪參益氣滴丸對(duì)移植后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活率的影響

PBS組未見(jiàn)有GFP+細(xì)胞，干細(xì)胞組共計(jì)數(shù)了45827個(gè)DAPI+細(xì)胞，其中GFP+細(xì)胞為4872個(gè)，占10.63%；干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸組共計(jì)數(shù)了49546個(gè)DAPI+細(xì)胞，其中GFP+細(xì)胞為7284個(gè)，占14.70%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明芪參益氣滴丸能提高M(jìn)SCs移植后的存活率。見(jiàn)表4、圖1。

表4 各組小鼠心肌內(nèi)骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的存活情況 (n=10)

注：藍(lán)色熒光為DAPI，代表細(xì)胞核；綠色熒光為GFP，代表移植的MSCs。

3 討論

既往研究表明，干細(xì)胞在體外具有自我更新、無(wú)限增殖以及分化為多種細(xì)胞的潛能[6]，大部分研究都把干細(xì)胞可以作為心肌再生的可靠來(lái)源。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是目前研究的最多的干細(xì)胞，臨床和動(dòng)物研究都表明干細(xì)胞移植確實(shí)能改善心功能、抑制心室重構(gòu)[7-8]。盡管MSCs具有向心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛力，但由于移植入梗死區(qū)存活的MSCs數(shù)量極少，其分化的效率和存活率均很低，因此限制了MSCs對(duì)于心肌梗死的治療效果[9]。如何提高移植MSCs的療效是亟待解決的問(wèn)題。在本研究中，課題組觀(guān)察了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸移植治療急性心肌梗死小鼠的有效性。與移植MSCs相比，芪參益氣滴丸聯(lián)合移植MSCs能進(jìn)一步增加邊緣區(qū)的微血管數(shù)量，抑制梗死區(qū)的細(xì)胞凋亡，以及促進(jìn)梗死區(qū)和邊緣區(qū)的細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明在治療小鼠急性心肌梗死方面，芪參益氣滴丸聯(lián)合移植MSCs的療效優(yōu)于單純移植MSCs。

心肌局部的微環(huán)境能影響MSCs的歸巢和存活，炎癥反應(yīng)、活性氧簇都能誘發(fā)MSCs凋亡，也能影響MSCs向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效率。研究者試圖在體外對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行一系列修飾，以增強(qiáng)其生存能力[10]，或者通過(guò)注射調(diào)控蛋白改善局部微環(huán)境，從而提高干細(xì)胞的存活率[11]，或者抑制局部的炎癥反應(yīng)，使得干細(xì)胞免受炎癥因子攻擊[12]。盡管實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述措施都是有效的，其臨床應(yīng)用卻存在諸多困難。不過(guò)這些研究表明，改善心肌局部的微環(huán)境是提高M(jìn)SCs存活的有效途徑。

目前，中藥的心肌保護(hù)作用受到較多的關(guān)注。芪參益氣滴丸是一種臨床上常用于治療急性心肌梗死和慢性心衰的復(fù)方中成藥，其四種主要成分為黃芪、丹參、三七、降香，藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)提示其有效成分具有抑制細(xì)胞凋亡、維持正常能量代謝、抗炎、清除氧自由基等多種藥理作用。芪參益氣滴丸也能通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝[13]，抑制細(xì)胞色素C釋放[14]，保護(hù)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能，減少白細(xì)胞浸潤(rùn)，從而減輕缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。有效成分丹參酮 ⅡA可增加B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白表達(dá)，下調(diào)急性心肌缺血時(shí)BCL-2同源的水溶性相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而減少心肌細(xì)胞凋亡[15]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是參與心肌缺血損傷過(guò)程的重要的細(xì)胞成分之一，三七總皂苷通過(guò)抑制NF-κB 的活化，減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷而起到心肌保護(hù)的作用[16]。三七總皂苷還能通過(guò)升高中性粒細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，抑制氧自由基生成，而抑制其釋放炎癥因子，減輕心肌細(xì)胞損傷[17]。由于芪參益氣滴丸具有上述多靶點(diǎn)多效應(yīng)的作用，因此課題組提出假設(shè)，芪參益氣滴丸可以顯著改善心肌梗死后局部組織微環(huán)境，提高移植入梗死區(qū)干細(xì)胞的存活，從而起到優(yōu)化干細(xì)胞移植效力，改善心梗后心室重構(gòu)的作用。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了此假說(shuō)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合芪參益氣滴丸治療心梗后心室重構(gòu)的療效優(yōu)于單獨(dú)行MSCs移植。