黃巾凌，孟令緣，盛煥精，崔生輝，閆韶飛，李鳳琴，楊保偉*

（1 西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院 陜西楊凌712100 2 中國食品藥品檢定研究院 北京102629 3 國家食品安全風險評估中心 北京100022）

沙門氏菌可引起食物中毒，導致腸胃炎、傷寒及副傷寒，是一類重要的食源性致病菌，在公共衛(wèi)生學上具有十分重要的意義。目前，抗生素仍然是對付包括沙門氏菌在內(nèi)諸多病原菌的首選。然而，隨著抗生素的廣泛使用，沙門氏菌的耐藥問題日趨嚴重，給人類和動物健康帶來極大威脅[1-3]。長期以來，大量學者以及政府部門對食源性沙門氏菌的藥敏性、耐藥菌株攜帶的編碼基因做了廣泛的調(diào)查和監(jiān)測[4-6]，然而仍缺乏在耐藥基因檢測中用作參比的標準樣品。為了更好、更快、更精準地了解介導食源性致病菌攜帶的耐藥基因和相關耐藥機制，檢測過程標準菌株的使用非常必要。

參考物質(zhì)（Reference material，RM）是一種已經(jīng)確定具有1 個或多個特性值的物質(zhì)或材料，各國管理機構對參考物質(zhì)的定義和要求表述各有不同。作為高度均勻、良好穩(wěn)定和量值準確的測量標準，參考物質(zhì)具有復現(xiàn)、保存和傳遞量值的基本功能。微生物標準物質(zhì)是食品類標準物質(zhì)中特殊的一類，我國微生物標準物質(zhì)的研制起步較晚，能用于檢驗檢測機構的相關標準物質(zhì)較少[7-8]。目前已研制出的微生物標準物質(zhì)主要應用于食源性致病菌的鑒定、病毒和轉(zhuǎn)基因成分檢測[9-10]，而關于介導相關耐藥機制的耐藥基因檢測用微生物標準物質(zhì)的研制，仍處于空白，急需開展此類標準物質(zhì)的研究，以保證食源性致病菌攜帶的耐藥基因檢測結(jié)果的準確性。

本研究遵循參考菌株研制規(guī)范，對前期研究中得到的部分菌株采用多種方法鑒定和研究，以期為參考菌株的制備提供菌株材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 118 株沙門氏菌分別于2008、2010、2011、2012年和2013年采集自廣東、北京、福建、上海、陜西、河南和四川等地農(nóng)貿(mào)市場和超市的零售食品及醫(yī)院的臨床生物樣品（人糞）。沙門氏菌標準菌株（Salmonella Typhimurium）LT2、藥敏性測定用質(zhì)控菌株大腸桿菌 （Escherichia coli）ATCC25922、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC35218 和糞腸球菌 （Enterococcus faecalis）ATCC29212 均為中國藥品生物制品檢定研究院惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 瓊脂培養(yǎng)基、MHA 培養(yǎng)基，北京陸橋技術股份有限責任公司；XLT4 培養(yǎng)基及其添加液，美國BD 公司。

1.1.3 抗生素 阿莫西林-克拉維酸（Amoxicillin-Clavulanic，AMC）、頭孢曲松（Ceftriaxone，CRO）、萘啶酮酸（Nalidixic acid，NAL）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、頭孢西丁（Cefoxitin，F(xiàn)OX）、頭孢噻呋（Ceftiofur，TIO）、氨芐西林（Ampicillin，AMP）、四環(huán)素（Tetracycline，TET）、氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、阿米卡星（Amikacin，AMK）、慶大霉素（Gentamicin，GEN）、磺胺異噁唑（Sulfisoxazole，SSS）、卡那霉素（Kanamycin，KAN）、鏈霉素（Streptomycin，STR）、復方新諾明（Trimethoprim-Sulfamethoxazole，SXT），美國Sigma 公司。

1.1.4 主要試劑和儀器

1.1.4.1 試劑 Taq DNA 聚合酶、10×PCR buffer（Mg 2+free）、MgCl2、dNTP mixture、DL2000 DNA marker、Loading buffer、Gel red，寶生物工程 （大連）有限公司。

1.1.4.2 儀器與設備-80 ℃超低溫冰箱 （MDF-3286S），日本SANYO 公司；-40 ℃超低溫冰箱（DW-FL208），中科美菱低溫科技有限責任公司；4℃冰箱（BCD-205TA），青島海爾股份有限公司；SW-CJ-1CU 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；GNP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DGX-9023電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗室設備有限公司；SB4200DT 微量移液槍，德國Effendorf 公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械公司；HH－4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京科偉儀器有限公司；Milli-QSynthesis 超純水機，德國Millipore 公司；XS204 百分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；BHW-8C 恒溫加熱器，上海博通股份有限公司；Mycircle 基因擴增儀、GELDOCXR 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-rad 公司；Hema9600 基因擴增儀，珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；PJ21C-AN 微波爐，美的集團；DYY-6C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；自動微生物分析系統(tǒng)（VITEK 2 COMPACT 60），法國梅里埃梅里埃公司；AUTO flex 飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS），德國Bruker 公司。

1.1.5 PCR 擴增和測序用引物 19 種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關編碼基因PCR 擴增和測序用引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成（表1）。

表1 PCR 擴增和測序用引物Table 1 Primers for PCR amplification and sequencing

（續(xù)表1）

1.2 試驗方法

1.2.1 沙門氏菌鑒定

1.2.1.1 革蘭氏染色 取潔凈載玻片，于玻片中央加一小滴無菌水。接種環(huán)火焰灼燒滅菌，冷卻后從LB 瓊脂培養(yǎng)基的單菌落上挑取少量沙門氏菌與玻片上的水滴混勻，涂成直徑10～15 mm 稀薄而均勻的圓形菌膜，自然干燥后將玻片有菌的一面向上，在酒精燈外焰上加熱固定[18]。在涂片上滴加適量草酸銨結(jié)晶紫染色液，初染60 s，水洗；除盡水滴后在涂片上滴加碘液，媒染60 s，水洗，除盡水滴；再在涂片上滴加乙醇，脫色25～30 s，水洗，除盡水滴；在細菌涂片上滴加番紅染色液，復染30～60 s，水洗；自然干燥后鏡檢。染色中使用金黃色葡萄球菌 ATCC29213 和大腸桿菌ATCC25922 分別作為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的質(zhì)控菌。

1.2.1.2 VITEK 生化鑒定 VITEK 生化鑒定在國家食品安全風險評估中心完成。鑒定時將沙門氏菌接種于LB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，挑取新鮮培養(yǎng)的菌落，制備菌懸液，接種VITEK COMPACT 2 菌種鑒定卡。依照操作說明書方法鑒定。

1.2.1.3 MALDI-TOF-MS 鑒定 MALDI-TOFMS 鑒定在國家食品安全風險評估中心完成。將沙門氏菌接種于LB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，挑取新鮮培養(yǎng)的菌落，按照質(zhì)譜鑒定操作說明，將待鑒定菌株涂布于MALDI-TOF-MS 靶板上，在靶孔加上HCCA 基質(zhì)（1 μL/孔），待基質(zhì)晾干后，將靶板放入質(zhì)譜儀工作室進行鑒定。

1.2.1.4 16S rDNA 基因擴增、序列測定和分析采用煮沸法制備PCR 用DNA 模板[19]。PCR 反應條件為：94 ℃，10 min；94 ℃，1 min；退火溫度下1 min；72 ℃，1 min；35 個循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR 反應的退火溫度因擴增基因引物序列組成而定。2 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在凝膠成像系統(tǒng)拍照留存。陽性PCR 產(chǎn)物在低溫條件下送至上海桑尼生物科技有限公司測序，測序數(shù)據(jù)通過BLAST 在線軟件進行分析和對比（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。

1.2.2 藥敏性測定 采用臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）[20]推薦的瓊脂稀釋法測定15 種抗生素對沙門氏菌的最小抑菌濃度 （Minimum Inhibitory Concentrations，MICs），按照CLSI 規(guī)定的標準判讀藥敏結(jié)果，確定耐藥表型。供試抗生素名稱、使用濃度范圍和耐藥折點如表3所示。藥敏性測定中使用大腸桿菌ATCC25922 和ATCC35218，糞腸球菌ATCC29212 作為質(zhì)控菌株。

表2 抗生素種類、使用范圍和耐藥折點Table 2 The category，concentration range and breakpoint of the antibiotic used for susceptibility test

1.2.3 菌株傳代培養(yǎng)及目標基因遺傳穩(wěn)定性測定基于沙門氏菌的基因型、攜帶的與β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關基因的種類及耐藥表型等結(jié)果，從118 株沙門氏菌中挑選出12 株代表性沙門氏菌進行傳代培養(yǎng)，隨機選擇其1，3，6，9，12，15 代菌株，檢測其β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關編碼基因的遺傳穩(wěn)定性。具體方法：將凍存管內(nèi)保藏的原代菌株劃線接種于LB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，即為1 代菌株；從每個1 代菌種培養(yǎng)物中隨機挑取3～5 個單菌落，分別劃線接種于另一LB 瓊脂培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。同時從該3～5 個單菌落中取菌，制做PCR 模板，對目標基因進行擴增和序列分析，檢測在傳代過程中目標基因有無丟失或發(fā)生變異。重復此步驟傳代至15 代，以檢測目標基因的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用Microsoft Office Excel 2010 對試驗所得數(shù)據(jù)進行處理和作圖，使用IBM SPSS Statistics 20.0 進行多因素方差分析（Duncan 法，P＜0.05）和多元回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)學鑒定 118 株沙門氏菌在XLT4 培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈黑色，具有金屬光澤（圖1a）。革蘭氏染色結(jié)果為粉紅色短桿狀細胞，革蘭氏陰性（圖1b）。

2.1.2 生化鑒定

2.1.2.1 VITEK COMPACT 2 鑒定 Vitek 鑒定結(jié)果表明118 株菌均為沙門氏菌，其中44（37.29%）株鑒定結(jié)果為99%可能性，43（36.44%）株為98%可能性，且二者無顯著性差異（P＞0.05），然而以上2 種可能性的菌株比例顯著（P＜0.05）高于可能性在95%～97%之間的菌株 （31，26.27%）（圖2，表3）。1 株沙門氏菌被鑒定為腸炎沙門氏菌，達到種鑒定水平，其余117 株均達到屬鑒定水平。

2.1.2.2 MALDI-TOF MS 鑒定 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果表明118 株菌均為沙門氏菌，全部可鑒定至屬水平（表3），其中1 株菌的鑒定圖譜如圖3所示。

2.1.3 16S rDNA 鑒定 16S rDNA 基因PCR 擴增、測序和Blast 在線比對分析結(jié)果表明118 株菌均為沙門氏菌，可鑒定至屬水平（表3）。118 株沙門氏菌16S rDNA 序列同源性在98.50%～99.90%之間。

2.2 沙門氏菌藥敏性

沙門氏菌對氨芐西林、磺胺異噁唑和頭孢噻呋的耐藥最為普遍，耐藥菌株比例間無顯著性差異（P＞0.05；比例均為100.00%）；對四環(huán)素和萘啶酮酸等7 種抗生素的耐藥率均在50%以上，然而對不同抗生素耐藥的菌株比例間存在顯著性差異。耐阿米卡星、慶大霉素和阿莫西林/克拉維酸的菌株比例較低，對環(huán)丙沙星和頭孢西丁比較敏感（表4）。

圖1 菌株的生長形態(tài)與革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Growth morphology and Gram staining result of the strain

圖2 VITEK COMPACT 2 生化鑒定結(jié)果（n=118）Fig.2 VITEK COMPACT 2 biochemical identification results （n=118）

圖3 1 株沙門氏菌MALDI-TOF MS 鑒定圖譜Fig.3 MALDI-TOF MS identification spectrum of one strain of Salmonella isolate

表3 3 種試驗鑒定結(jié)果分析Table 3 Analysis of 3 kinds of experimental identification results

2.3 β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關基因及其遺傳穩(wěn)定性

2.3.1 沙門氏菌中與β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關基因的檢出率 在118 株沙門氏菌中共檢出8種與β-內(nèi)酰胺或/和超廣譜β-內(nèi)酰胺（Extended spectrum β-lactams，ESBLs） 類抗生素耐藥相關的編碼基因，分別為：blaTEM-1、blaTEM-116、blaOXA-1、blaC-TX-M-3、blaCTX-M-55、blaCTX-M-123、blaCTX-M-64和blaCTX-M-15。其中，76（64.41%）株沙門氏菌攜帶blaTEM-1，攜帶其它基因的菌株及相應的檢出率分別為blaCTX-M-55（50.85%）、blaOXA-1（16.10%）、blaCTX-M-3（15.25%）、blaCTX-M-15（1.69%）、blaTEM-116（1.69%）、blaCTX-M-123（0.85%）和blaCTX-M-64（0.85%）。blaTEM-1檢出率最高，顯著高于blaTEM-116、blaOXA-1、blaCTX-M-3、blaCTX-M-55、blaCTX-M-123、blaCTX-M-64和blaCTX-M-15陽性菌株的檢出率（P＜0.05），見圖4。

2.3.2 blaTEM-1、blaOXA-1和blaCTX-Ms遺傳及表達穩(wěn)定性 12 株攜帶β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的代表性沙門氏菌涵蓋愛丁堡、腸炎、湯普森、舒卜拉、印第安納、烏普薩拉和阿伯尼等7 種血清型，每個血清型的沙門氏菌至少攜帶2 種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關編碼基因。菌株傳代、目標基因PCR 擴增及序列比對分析結(jié)果表明，傳代過程中目標基因未丟失，未發(fā)生任何基因變異，證明blaTEM-1、blaOXA-1和blaCTX-Ms基因在菌株1～15 代遺傳過程中可非常穩(wěn)定的存在（圖5）。

3 討論

諸多食品安全風險中，微生物污染已成為全球公認的首要威脅，基于這一問題，很多國際組織相繼制定了食品中微生物的限量標準與檢測方法[1-3]。在我國，隨著國家對食品安全問題的日益重視，食品檢驗方法也逐漸趨于標準化，先后制定了GB4789 系列食品安全國家標準[21]。由于食品安全檢驗工作的重要性，因此檢驗過程和結(jié)果需要更加規(guī)范化，而作為檢驗標尺的參考物質(zhì)則成為聚焦點。此外，我國食品安全戰(zhàn)略對微生物鑒定、分型、耐藥和溯源類參考物質(zhì)也有著迫切需求[22-23]。

然而，食品微生物類參考物質(zhì)目前卻基本停留在由菌種保藏機構提供純菌種的初級階段，且這些菌種保藏機構均未將食品微生物作為主要收藏對象，致使與食品監(jiān)督抽驗和中毒等相關的重要微生物資源嚴重缺失。國外權威機構，如：法國梅里埃公司和歐盟聯(lián)合實驗室，雖已開始制備Bioball 微球等定量或定性微生物參考物質(zhì)，然而由于生物安全問題，這些參考物質(zhì)在國際共享過程中出現(xiàn)許多困難[24-25]。我國《食品安全國家標準食品微生物學檢驗總則》（GB 4789.1-2016）[26]中明確要求定期使用陽性對照對檢驗過程進行質(zhì)量控制，同時在《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》（CNAS-CL09-2013）[27]中也明確要求使用微生物標準物質(zhì)或者質(zhì)控樣品對微生物檢驗進行質(zhì)量控制。因此，對食品中微生物及相關特性檢測用標準物質(zhì)的研發(fā)勢在必行。

表4 沙門氏菌的藥敏性（n=118）Table 4 Antibiotic susceptibility of Salmonella（n=118）

圖4 8 種基因在沙門氏菌中的檢出率（n=118）Fig.4 Detection rates of eight genes in Salmonella （n=118）

近幾年，我國雖在食品、環(huán)境和臨床等領域研發(fā)了多項參考物質(zhì)[28-32]，建立了國家參考物質(zhì)資源共享平臺，然而由于微生物自身易受污染、變化快、內(nèi)部代謝機制復雜的特點，使得平臺上適用于食品微生物檢測的參考物質(zhì)較少。另外，由于微生物為活體物質(zhì)，參考物質(zhì)制備時必然具有其特殊性，即：均勻性和穩(wěn)定性難控制，制備程序和工藝復雜，定值和不確定度評估困難，因此，相對來講我國目前關于微生物類參考物質(zhì)的研究總體較少。據(jù)文獻報道，駱海朋等[9]、瞿洪仁等[10]已研制出阪崎克羅諾桿菌和單增李斯特氏菌標準物質(zhì)。國內(nèi)少數(shù)機構也逐步開展了帶有食品基質(zhì)的微生物參考品研究，然而由于參考物質(zhì)溯源性不強，不確定度評價模式單一等嚴重缺陷，導致同一樣品的檢測值參差不齊，無法為食品檢驗數(shù)據(jù)提供技術保障。

在食源性致病菌的研究中，要對微生物某一特性進行檢測，其編碼基因往往被作為靶標。而用作該靶標檢測的標準菌株不僅必須攜帶該編碼基因，而且該編碼基因必須在菌株傳代、培養(yǎng)、貯藏和交換過程能夠穩(wěn)定存在。圍繞這一目標，本研究的最終目的是篩選出可用于β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性菌株相關耐藥機制檢測用參考菌株制備的候選菌株，因此對這些菌株的鑒定、菌株特性及其攜帶相關基因遺傳穩(wěn)定性的研究極其重要。本試驗根據(jù)微生物參考菌株制備要求及相關流程，首先對118 株不同來源的沙門氏菌采用4 種方法進行鑒定，并檢測其藥敏性，結(jié)合前期獲得的樣品來源、采樣時間、采樣地點，基于脈沖場凝膠電泳（Pulse field gel electrophoresis，PFGE） 的基因型和中國醫(yī)學細菌保藏管理中心（CMCC）標準菌株編號等信息，最終篩選出12 株代表性沙門氏菌作為制備參考菌株的潛在菌株。試驗結(jié)果表明，這12 株沙門氏菌的相關特性均符合標準物質(zhì)制備要求，具有進一步制備β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性菌株相關耐藥機制檢測用參考菌株的條件，完全滿足制備用于β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性編碼基因檢測用標準菌株的可能性。后期，將進一步對其進行冷凍干燥、瓶間菌數(shù)不確定度及貯藏穩(wěn)定性試驗，最終形成已定量的即用型活體菌株，獲得國家級標準物質(zhì)證書，用于快檢和臨檢。

圖5 bla 基因的穩(wěn)定遺傳性Fig.5 The stable inheritability of bla genes