張龍舉，劉曉麗，杜 飛，李云飛，王 菊

(1.遵義市第一人民醫(yī)院/遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科一病區(qū)，貴州 遵義 563000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD,簡(jiǎn)稱慢阻肺)是全球危害人類健康、導(dǎo)致死亡的一種常見(jiàn)疾病。目前研究認(rèn)為，COPD是一種由吸煙誘發(fā)的，T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cells,DCs)等多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的炎性反應(yīng)與異常的自身免疫應(yīng)答相關(guān)的疾病，COPD的主要發(fā)病機(jī)制是基于對(duì)吸入有毒顆?；驓怏w的先天性或適應(yīng)性免疫反應(yīng)[1]。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、DCs、B細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞通常被認(rèn)為是主要的效應(yīng)細(xì)胞[2-5]，但DCs作為目前最重要的抗原遞呈細(xì)胞，由它啟動(dòng)的獲得性免疫應(yīng)答過(guò)程在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用了解甚少，DCs是目前已知功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，被認(rèn)為是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，能夠顯著刺激初始T細(xì)胞活化增殖與分化，誘導(dǎo)特應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，隨著人們對(duì)COPD免疫炎性反應(yīng)發(fā)病機(jī)制的深入研究，也開(kāi)始關(guān)注DCs在COPD中可能的發(fā)病機(jī)制。本研究擬通過(guò)觀察樹(shù)突狀細(xì)胞在肺氣腫小鼠模型中的表達(dá)情況以及紅霉素干預(yù)的效應(yīng)，為臨床慢阻肺防治提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：取SPF級(jí)健康BALB/C小鼠40只[購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0007]，體重為(22 ± 4)g，鼠齡6～8周，飼養(yǎng)于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；隨機(jī)分為四組，每組10只。分別為空白對(duì)照組、模型組、紅霉素預(yù)防組和紅霉素治療組。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：自制有機(jī)玻璃煙熏艙1個(gè)(規(guī)格55cmx45cmx35cm)；黃果樹(shù)牌香煙，每支煙草含焦油量12 mg，煙堿含量1.1 mg；紅霉素腸溶膠囊(購(gòu)自重慶天圣制藥股份有限公司)；小鼠33D1單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ 生物技術(shù)公司)；CD40、CD80、CD86熒光定量PCR試劑盒(日本takara公司)；SYBR? Premix Ex Taq(購(gòu)自Takara公司，RR820A，即SYBR green溶液)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(購(gòu)自Takara公司，RR047A，即逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)；RNAiso Plus(購(gòu)自Takara，9108，即Trizol)；氯仿(Trichloromethane，購(gòu)自上海阿拉丁生化，C128130);異丙醇(isopropanol，購(gòu)自上海阿拉丁生化，I112011);乙醇(ethanol，購(gòu)自上海阿拉丁生化，E111989)；DEPC(Diethyl pyrocarbonate，購(gòu)自上海阿拉丁生化，D105557);Stepone plus 熒光定量PCR(ABI);PCR儀(ABI，Veriti);Nano drop 2000(購(gòu)自Thermo fisher公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.3.1小鼠肺氣腫模型的建立及紅霉素干預(yù)方法：將小鼠隨機(jī)分為四組，每組10只。分別為空白對(duì)照組、模型組、紅霉素預(yù)防組和紅霉素治療組。模型組、 紅霉素預(yù)防組、紅霉素治療組給予煙熏24周建立小鼠肺氣腫模型，紅霉素預(yù)防組從第20周開(kāi)始給予紅霉素(80 mg/kg)灌胃進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)治療共4周；紅霉素治療組從第25周開(kāi)始給予紅霉素(80 mg/kg)灌胃治療共4周然后處死小鼠。

1.3.2肺組織取材檢查:實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組大鼠麻醉后處死，取出肺組織，常規(guī)石蠟包埋切片, HE 染色觀察小鼠肺內(nèi)炎癥浸潤(rùn)情況 ；免疫組化檢測(cè)各組肺組織樹(shù)突狀細(xì)胞33D1的表達(dá)；在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織中樹(shù)突狀細(xì)胞33D1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肺組織DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86mRNA的表達(dá)：取小鼠肺組織約0.5 g剪碎，按照RNAiso Plus說(shuō)明書的步驟提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒并參照其步驟逆轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒并嚴(yán)格按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，RT-PCR引物序列見(jiàn)表1。以GADPH為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt算法對(duì)各組mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1氣道炎性反應(yīng)病理學(xué)觀察：肺組織切片的蘇木精-伊紅染色,鏡下可見(jiàn)空白對(duì)照組肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，氣管及血管周圍未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組可見(jiàn)小鼠氣道黏膜固有層中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),氣道黏液分泌增多，氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主，肺泡壁破碎，形成肺大皰，紅霉素預(yù)防組和紅霉素治療組的兩組炎性反應(yīng)明顯減輕，表明紅霉素預(yù)防治療后得到緩解表現(xiàn)出一定的療效。 見(jiàn)圖1。

空白對(duì)照組：肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，氣管及血管周圍未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組：大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁破碎，形成肺大皰;紅霉素預(yù)防組：肺組織病理改變較模型組減輕;紅霉素治療組： 支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組組減少圖1 肺組織病理學(xué)改變(蘇木精-伊紅染色)

2.2小鼠肺組織樹(shù)突狀細(xì)胞33D1抗原的表達(dá)：空白對(duì)照組33D1幾乎未表達(dá)，模型組 33D1陽(yáng)性表達(dá)明顯增多。紅霉素干預(yù)后預(yù)防組和治療組 33D1 表達(dá)均明顯減少,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01),而紅霉素預(yù)防組和治療組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、圖 3。

2.3熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肺組織DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86mRNA的表達(dá)：與對(duì)照組相比，模型組肺組織中DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86mRNA明顯增多，紅霉素干預(yù)后表達(dá)下降，但仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

模型組肺組織 33D1表達(dá)高, 紅霉素預(yù)防組和治療組表達(dá)均有減少圖2 肺組織中 33D1表達(dá)(免疫組化 ABC法染色 )

a：與正常對(duì)照組相比，P<0.05；b：與模型組相比，P<0.05圖3 肺組織中每200倍視野 33D1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)

a:與對(duì)照組相比，P<0.01;b:與對(duì)照組比較，P<0.05;c:與模型組比較，P<0.01;d:與模型組比較，P<0.05圖4 小鼠肺組織DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86mRNA的表達(dá)

3 討論

目前認(rèn)為，COPD是一種由吸煙誘發(fā)的，樹(shù)突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞參與的炎性反應(yīng)與異常的自身免疫應(yīng)答相關(guān)的疾病，煙草煙霧暴露是導(dǎo)致COPD最重要的發(fā)病因素，煙草煙霧提取物和尼古丁能夠影響DCs的成熟和功能[6]，但目前研究結(jié)論不一。除了DCs外，研究表明，COPD肺組織中DCs共刺激分子也是增高的,Freeman等研究表明，COPD肺組織DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86、CD83明顯增高，并且與疾病的嚴(yán)重度相關(guān)[7]。但由DCs啟動(dòng)的獲得性免疫應(yīng)答過(guò)程在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用還不十分清楚。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不僅具有抗炎作用，而且還具有免疫調(diào)節(jié)作用，相關(guān)研究表明，大環(huán)內(nèi)酯類可以減少慢阻肺患者急性加重癥狀，改善肺功能和生活質(zhì)量[8-9]，Iino等證實(shí)，大環(huán)內(nèi)酯類還可以抑制抗原遞呈細(xì)胞共刺激分子CD54、CD80與CD86的表達(dá)；但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，大環(huán)內(nèi)酯類藥物紅霉素干預(yù)可以減輕煙草煙霧暴露肺氣腫小鼠氣道的炎性反應(yīng)，表明紅霉素預(yù)防治療后得到緩解，表現(xiàn)出一定的抗炎療效，進(jìn)一步的研究顯示，肺氣腫小鼠肺組織樹(shù)突狀細(xì)胞33D1抗原及共刺激分子CD40、CD80、CD86mRNA明顯增多，提示DCs及共刺激分子共同參與了小鼠肺氣腫的發(fā)病過(guò)程，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，紅霉素干預(yù)后預(yù)防組和治療組 33D1及共刺激分子 表達(dá)均明顯減少，但仍高于對(duì)照組。本研究進(jìn)一步證實(shí)，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素可以降低氣道炎性反應(yīng)，并起到免疫調(diào)節(jié)的作用，主要是通過(guò)調(diào)控氣道和肺組織中DCs細(xì)胞和共刺激分子，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

樹(shù)突狀細(xì)胞及共刺激分子參與肺氣腫發(fā)病，紅霉素可下調(diào)肺氣腫肺組織樹(shù)突狀細(xì)胞及共刺激分子表達(dá)水平，減輕肺氣腫肺部炎性反應(yīng)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。