王佩瑾，林赟羽

(寧?？h第一醫(yī)院 呼吸科，浙江 寧波 315600)

非小細(xì)胞型肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見(jiàn)的肺癌病理學(xué)亞型，主要有腺癌(AC)和鱗狀細(xì)胞癌(SCC)[1]。早期準(zhǔn)確診斷對(duì)NSCLC患者的治療十分重要[2]。miRNAs對(duì)細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡等生物學(xué)和病理學(xué)過(guò)程有重要影響，在腫瘤中可作為致癌基因(onco-miRNA)和腫瘤抑制miRNA[3-4]。無(wú)細(xì)胞miRNAs在體液(血漿、血清和尿液等)中可穩(wěn)定存在，顯示了miRNAs作為腫瘤早期診斷標(biāo)志物的潛力[5-6]。本研究旨在評(píng)估5種miRNA(miR-21-5p，miR-30a-5p，miR-126-3p，miR-210-3p，miR-486-5p)在NSCLC患者血清樣本中的表達(dá)水平及其診斷能力，以期為NSCLC的早期診斷提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集2009年1月—2013年3月于寧海縣第一醫(yī)院治療的符合中國(guó)原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)的原發(fā)性NSCLC患者50例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查或病理組織學(xué)明確診斷為NSCLC；②均未接受過(guò)抗腫瘤治療，包括放療、化療、手術(shù)及靶向治療等。排除患有其他系統(tǒng)疾病患者及孕婦、哺乳期女性患者。NSCLC患者中男38例，女12例；平均年齡(65.9±2.3)歲；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第7版原發(fā)腫瘤局部淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分期(TNM)[8]對(duì)NSCLC組分類：AC患者14例，SCC患者30例，6例患者腫瘤成分復(fù)雜；T1期7例，T2期28例，T3期10例，T4期5例。另選取29例健康個(gè)體為健康對(duì)照組，其中男23例，女6例；平均年齡(70.1±3.0)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所選患者均簽署知情同意書。

1.2 血清miRNA水平檢測(cè) 空腹取靜脈血約5 mL于無(wú)菌EDTA抗凝管中，室溫下靜置30～60 min，1 300 g離心10 min，取血清于-80 ℃保存。取血清1 mL加入Trizol 提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，檢測(cè)血清中5 種miRNA表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄程序：在去核酶PCR 薄管中加入反應(yīng)物，

充分混合3～5 s，70℃ 孵育5 min，迅速放入冰中冷卻。再加入其他反應(yīng)物充分混勻，短暫離心，42℃ 孵育90 min，70℃ 加熱10 min，冷卻終止反應(yīng)。擴(kuò)增基因片段：95℃預(yù)變性1 min，95℃ 15 s、60℃ 20 s、70℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)，然后95℃延伸反應(yīng)20 s。以U6作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)正態(tài)分布，通過(guò)Levene檢驗(yàn)檢查方差的同質(zhì)性。組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)miRNA水平之間關(guān)聯(lián)性，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估m(xù)iRNA水平和患者總生存時(shí)間(OS)的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者血清miRNA表達(dá) 與健康對(duì)照組比較，NSCLC組患者血清中的miR-21-5p、miR-30a-5p和miR-126-3p下調(diào)，miR-210-3p和miR-486-5p上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

與健康對(duì)照組比較，**P<0.01,***P<0.001。圖1 NSCLC患者血清miRNA表達(dá)水平Figure 1 Serum miRNA expression in patients with NSCLC

2.2 不同病理特征NSCLC患者miRNA水平 比較5種miRNA 在NSCLC腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平，miR-210-3p在NSCLC腺癌和鱗狀細(xì)胞癌患者血清中的水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同病理特征NSCLC患者miRNA水平Table 1 MiRNA levels in NSCLC patients with different pathological features

2.3 miR-210-3p對(duì)NSCLC腺癌的診斷價(jià)值 MiR-210-3p對(duì)NSCLC腺癌的ROC曲線下面積為0.84(95%CI: 0.72～0.96)，敏感度為86%，特異度為79%，見(jiàn)圖2。

圖2 miR-210-3p對(duì)NSCLC腺癌診斷的ROC曲線Figure 2 ROC curve of miR-210-3p for NSCLC adenocarcinoma

2.4 miRNA水平與總生存時(shí)間的關(guān)系 NSCLC組中17名患者總生存時(shí)間數(shù)據(jù)缺失，對(duì)33名NSCLC患者進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，調(diào)整性別、年齡和吸煙時(shí)間因素后，NSCLC患者miR-210-3p水平與總生存時(shí)間相關(guān)(P=0.03)。見(jiàn)表2。

表2 NSCLC患者miRNA水平與總生存時(shí)間的關(guān)系(n=33)Table 2 Relationship between miRNA level and overall survival in NSCLC patients(n=33)

3 討論

研究[9]表明，缺氧條件下miR-210-3p在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，其可能作為致癌基因和腫瘤抑制因子。本研究結(jié)果顯示，miR-210-3p在NSCLC患者血清中表達(dá)明顯上調(diào)。先前報(bào)道[10-11]指出，miR-210-3p在NSCLC患者血清和血漿樣品中上調(diào)，與本研究結(jié)果一致。另外，本研究結(jié)果顯示，與鱗狀細(xì)胞癌相比，NSCLC腺癌miR-210-3p表達(dá)明顯上調(diào)，miR-210-3p對(duì)NSCLC腺癌的ROC曲線下面積為0.84。Shen 等[12]研究結(jié)果表明，miR-210-3p診斷腺癌比診斷鱗狀細(xì)胞癌具有更高的敏感度。本研究結(jié)果表明，血清miR-210-3p與NSCLC患者總生存時(shí)間存在潛在關(guān)聯(lián)。早期研究[13]表明，miR-210-3p在NSCLC組織中的高表達(dá)與更長(zhǎng)的存活率相關(guān)。而另一項(xiàng)研究[14]觀察到，腺癌組織中miR-210的高表達(dá)是縮短腺癌患者無(wú)病生存期的獨(dú)立預(yù)后因素，相關(guān)結(jié)果還需進(jìn)一步大樣本驗(yàn)證。

以往研究[15-16]顯示，與健康對(duì)照組相比，miR-126-3p在NSCLC患者中表達(dá)水平下調(diào)[16]，可作為NSCLC潛在的血液生物標(biāo)志物，與本研究結(jié)果一致。研究[17]報(bào)道，miR-30a-5p在NSCLC患者血清中明顯上調(diào)，但在癌組織樣品中表現(xiàn)出上調(diào)，本研究結(jié)果顯示，miR-30a-5p在NSCLC患者血清中明顯下調(diào)。此外，miR-21-5p在NSCLC患者血清樣本中下調(diào)，與Abdollahi等[18]研究結(jié)果一致，該研究顯示NSCLC患者中miR-21-5p顯著升高，且與腫瘤分期相關(guān)。本研究結(jié)果顯示miR-486-5p在NSCLC患者血清中上調(diào)，而Shen等[12]報(bào)道m(xù)iR-486-5p在NSCLC患者血清中下調(diào)，且與NSCLC患者的總生存時(shí)間相關(guān)。另有研究[19]報(bào)道m(xù)iR-486-5p的高表達(dá)可作為一種優(yōu)化預(yù)后因子，而Li等[20]的研究則表明miR-486-5p表達(dá)上調(diào)與不利生存相關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果顯示miR-21-5p、miR-30a-5p、miR-126-3p、miR-210-3p和miR-486-5p在NSCLC患者血清中表達(dá)水平改變。miR-210-3p對(duì)NSCLC腺癌有一定的診斷價(jià)值，后續(xù)需進(jìn)行大樣本量驗(yàn)證。