余明軍，王海明

(杭州市第三人民醫(yī)院 外科，浙江 杭州 310009)

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤[1]，近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)，為女性腫瘤發(fā)病率第1位，男性腫瘤發(fā)病率第2位[2]。大部分甲狀腺癌在手術(shù)切除結(jié)合碘131及甲狀腺素治療后可達(dá)到臨床治愈，但仍存在5%的5年復(fù)發(fā)率[3]。MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。研究表明，miR-142-3p在宮頸癌、腎癌、急性白血病、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、骨肉瘤、食管癌、胰腺癌及乳腺癌等惡性腫瘤中均存在異常表達(dá)[4-8]，并且miR-142-3p可直接靶向細(xì)胞周期蛋白CDC25C，促癌基因HMGB1、TGFβR1，及多種干細(xì)胞表面特異分子如CD133、Lgr5、ABCG2，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、周期、凋亡等。Jahanbani等[9]證實(shí)miR-142-3p在甲狀腺癌組織中低表達(dá)。本研究檢測(cè)甲狀腺癌細(xì)胞及正常甲狀腺細(xì)胞中miR-142-3p 的表達(dá)水平，研究miR-142-3p 對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖能力、單克隆形成能力及細(xì)胞周期的影響，以期為甲狀腺癌早期診斷、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)及尋找新治療靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 Real-time PCR 試劑盒購(gòu)自上海欣百諾生物工程有限公司，RPMI1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，miR-142-3p mimics、miR-142-3p inhibitor、NC mimics購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，MTT溶液、DMSO溶液、流式周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗人Anti-Cyclin D1購(gòu)自美國(guó)AbCam 公司，鼠抗人β-actin購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人甲狀腺癌細(xì)胞K1、TPC-1、BCPAP和人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。K1細(xì)胞在含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，TPC-1、BCPAP和Nthy-ori 3-1細(xì)胞在含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37℃、5% CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 miR-142-3p的RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟操作，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K1、TPC-1、BCPAP和Nthy-ori 3-1細(xì)胞，加入適量Triozl 細(xì)胞裂解液提取RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度，定量后用DEPC水稀釋至500 ng/μL，合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，正向引物：5’CATGAGAAG TATGACAACAGCCT3’，反向引物：5’AGTCCTTCCAC GATACCAAAGTT3’；miR-142-3p上游引物為：5’ACA CTCCAGCTGGCTGTAGTGTTTCCTACT3’。miR-142-3p相對(duì)定量用2-△△CT計(jì)算。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K1細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細(xì)胞單層密度達(dá)到50%～60%時(shí)，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。陰性對(duì)照組(NC)、miR-142-3p mimics組和miR-142-3p inhibitor組分別轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor，轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 MTT 實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 24 h后，收集細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，初始細(xì)胞數(shù)為1 500個(gè)/孔，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。設(shè)置24、48、72、96、120 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。避光條件下，每孔加入MTT 溶液20 μL(5 mg/mL)孵育4 h后終止培養(yǎng)。負(fù)壓吸引器小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，搖床上低速振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔490 nm的吸光度(OD值)，計(jì)算平均值并繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 24 h后收集細(xì)胞，各組細(xì)胞按500個(gè)/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每孔補(bǔ)足完全培養(yǎng)基至1.5 mL，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10天，每2～3天更換新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng)，用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min，通風(fēng)處風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，沖洗風(fēng)干后拍照。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 24 h后，用0.25%無(wú)EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS重懸離心后加入預(yù)冷的75%乙醇，4℃固定過(guò)夜。加入400 μL 0.05 g/L PI，室溫避光孵育30 min后混勻，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 48 h后收集細(xì)胞，加入80～100 μL裂解液，冰上裂解30 min后，12 000 rpm(離心半徑13.5 cm)，4℃離心30 min。上清液蛋白定量后，加入5×loading buffer，沸水浴15 min使蛋白變性。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后200 mA轉(zhuǎn)膜1 h。硝酸纖維素膜蛋白面向上放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫于搖床低速搖動(dòng)，封閉1 h。加入一抗，4 ℃避光孵育過(guò)夜，一抗稀釋倍數(shù)：Cyclin D1(1∶5 000)，β-actin(1∶1 000)。PBST洗滌NC膜后加二抗室溫避光孵育2 h。PBST洗膜3次后，NC膜蛋白面朝下上機(jī)掃描，應(yīng)用Odyssey 蛋白質(zhì)分析成像系統(tǒng)顯像，通過(guò)獲取目的條帶的灰度值作為表達(dá)強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-142-3p表達(dá)檢測(cè) RT-PCR結(jié)果顯示，miR-142-3p在甲狀腺癌細(xì)胞K1、TPC-1、BCPAP中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.228±0.127、1.688±0.105、1.974±0.173，甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1中miR-142-3p的相對(duì)表達(dá)量為2.842±0.144。甲狀腺癌細(xì)胞K1、TPC-1、BCPAP中的miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量均低于甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3種甲狀腺癌細(xì)胞中K1 細(xì)胞的miR-142-3p表達(dá)量最低。見(jiàn)封三圖1。

2.2 miR-142-3p對(duì)細(xì)胞增殖的影響 甲狀腺癌細(xì)胞K1轉(zhuǎn)染后24 h，NC組、miR-142-3p mimics組和miR-142-3p inhibitor組的OD值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。從轉(zhuǎn)染后48 h開(kāi)始，3組細(xì)胞增殖能力開(kāi)始出現(xiàn)差異。轉(zhuǎn)染后120 h，與NC組OD值(0.820 5±0.025 5)相比，miR-142-3p mimics組細(xì)胞OD值(0.559 0±0.013 5)降低，miR-142-3p inhibitor組細(xì)胞OD值(1.116 5±0.029 3)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖1。

***與NC組比較，P<0.001。圖1 miR-142-3p對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞K1增殖能力的影響Figure 1 Effect of miR-142-3p on proliferation of thyroid cancer cell line K1

2.3 miR-142-3p對(duì)細(xì)胞單克隆形成的影響 甲狀腺癌細(xì)胞K1轉(zhuǎn)染后，miR-142-3p mimics組細(xì)胞克隆形成少于NC組，且單個(gè)克隆小于NC組；miR-142-3p inhibitor組細(xì)胞克隆形成多于NC組，且單個(gè)克隆大于NC組。見(jiàn)封三圖2。

2.4 miR-142-3p對(duì)細(xì)胞周期的影響 甲狀腺癌細(xì)胞K1轉(zhuǎn)染后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組G0/G1期細(xì)胞百分比為(61.18±2.09)%，miR-142-3p mimics組G0/G1期細(xì)胞百分比為(74.89±2.09)%，miR-142-3p inhibitor組G0/G1期細(xì)胞百分比為(52.07±2.76)%，miR-142-3p mimic組G0/G1期細(xì)胞百分比高于NC組，miR-142-3p inhibitor組G0/G1期細(xì)胞百分比低于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)封三圖3A。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-142-3p mimics組Cyclin D1蛋白表達(dá)量下降，miR-142-3p inhibitor組Cyclin D1蛋白表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)封三圖3B。

3 討論

研究表明，甲狀腺癌組織中存在microRNA的差異表達(dá)[9-11]。甲狀腺腫瘤microRNA表達(dá)譜的改變可作為生物學(xué)標(biāo)志用于早期診斷，修復(fù)或抑制microRNA在甲狀腺癌細(xì)胞中的表達(dá)有可能為開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物提供新思路。

現(xiàn)有研究[4-9]表明，miR-142-3p在包括甲狀腺癌在內(nèi)的多種癌癥中表達(dá)下調(diào)，但其在甲狀腺癌中的作用機(jī)制尚不明確。本研究采用RT-PCR檢測(cè)人甲狀腺癌細(xì)胞株和正常甲狀腺細(xì)胞中miR-142-3p的表達(dá)水平，結(jié)果表明miR-142-3p在甲狀腺癌細(xì)胞K1、TPC-1、BCPAP中表達(dá)明顯降低，與Jahanbani等[9]研究結(jié)果相吻合，提示miR-142-3p在甲狀腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的作用。轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor的K1細(xì)胞經(jīng)MTT 法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，miR-142-3p mimics 組細(xì)胞增殖減慢，單克隆形成減少，而miR-142-3p inhibitor組細(xì)胞增殖增強(qiáng)、單克隆形成增加，說(shuō)明高表達(dá)miR-142-3p可以明顯抑制K1細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)及Western Blot對(duì)Cyclin D1蛋白的檢測(cè)結(jié)果表明，外源性升高miR-142-3p的表達(dá)后，Cyclin D1表達(dá)被抑制，K1細(xì)胞被阻滯于G0/G1期。本研究結(jié)果提示，miR-142-3p在甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，通過(guò)抑制Cyclin D1的表達(dá)抑制細(xì)胞分裂，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，對(duì)癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，miR-142-3p 在甲狀腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，高表達(dá)miR-142-3p可有效抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖能力，通過(guò)抑制Cyclin D1表達(dá)將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。