趙長海,張辰銘,孫春陽,郭文博,王 強(qiáng),焦成斌
(1.佳木斯市中心醫(yī)院普外科,黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科,黑龍江 佳木斯 154002)
甲狀腺癌(thyroid carcinoma,TC)是一種內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤,其發(fā)病率逐年增加,以女性較為多見,其中90%以上為分化型甲狀腺癌[1,2]。近年來對甲狀腺癌的研究表明多種基因表達(dá)異常與其惡性生物學(xué)特點(diǎn)密切相關(guān),然而對于甲狀腺癌的具體發(fā)病分子機(jī)制尚未完全明確。人類P53 位于染色體17p13.1,目前已證實(shí)其在多種進(jìn)展期、轉(zhuǎn)移性腫瘤(腦腫瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等)中發(fā)生高頻率突變或缺失是一種普遍現(xiàn)象[3]。突變型P53 具有抑制野生型P53 的功能,可使DNA的修復(fù)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、調(diào)節(jié)代謝等腫瘤抑制功能喪失,同時(shí)還可促進(jìn)腫瘤成形,這種突變體被稱為TP53[4]。人類Wnt-5a 位于染色體3p14-21,是人體生長發(fā)育和病理修復(fù)過程中的一個(gè)關(guān)鍵因子,研究表明[5,6],各種蛋白質(zhì)能結(jié)合細(xì)胞膜表面不同的Wnt-5a 受體,在細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)中參與細(xì)胞的分裂與凋亡。目前有關(guān)TP53、Wnt-5a 在甲狀腺癌中表達(dá)模式及其與甲狀腺癌臨床病理分期關(guān)系的研究較少,基于此,本研究主要分析不同臨床分期的甲狀腺癌中TP53 和Wnt-5a 的表達(dá)特點(diǎn),探討其在甲狀腺癌中表達(dá)的臨床意義。
1.1 一般資料 收集2004 年7 月~2013 年9 月佳木斯市中心醫(yī)院經(jīng)過病理證實(shí)的50 例甲狀腺癌組織、10 例癌旁正常腺體組織的石蠟標(biāo)本及23 例甲狀腺癌組織、10 例癌旁正常腺體組織的新鮮標(biāo)本。石蠟標(biāo)本中男性15 例,女性35 例,年齡20~77 歲,中位年齡41 歲;手術(shù)新鮮組織標(biāo)本中男性13 例,女性20 例,年齡27~67 歲,中位年齡52 歲;依據(jù)美國腫瘤聯(lián)合協(xié)會(AJCC)進(jìn)行臨床分期[7,8]:石蠟標(biāo)本中甲狀腺癌Ⅰ~Ⅱ期14 例、Ⅲ~Ⅳ期36 例。新鮮組織標(biāo)本中甲狀腺癌Ⅰ~Ⅱ期7 例、Ⅲ~Ⅳ期16 例。
1.2 主要試劑及器材 TP53 突變兔抗人多克隆抗體從上海蘭頓生物技術(shù)股份有限公司購買,兔抗人的Wnt-5a 多克隆抗體購自上海蘭頓生物科技有限公司,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購自北京翰譜醫(yī)藥生物研究所。β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG 抗體、BCA、SDS-PAGE kit、考馬斯亮藍(lán)染色液、DNA和蛋白電泳標(biāo)記Marker,ECL 超敏反應(yīng)發(fā)光液、純硝酸纖維素膜、麗春紅染色被購自北京博奧生物有限公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、PCR 儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司型號:9800)、分析軟件和凝膠圖像分析系統(tǒng)BTNTA2020D(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。PBS 1 L、0.01 mol/L 檸檬酸鹽液、0.5 mol/L EDTA 緩沖液(pH 8.0)、1 mol/L 的TBS 緩沖液(pH 8.0)、酶消化液、封片劑。通過NCBI 中GeneBank 搜索框查詢到P53 的order cDNA 框中顯示P53 引物5-TCTGTCACTTGCACGTACTC-3,下游引物:5 端-CACGGATGTGAAGGGTGAAA-3 端。Wnt-5a 引物序 列:5-GACCTGGTCTACAT-CGACCCC-3 端,5端-GCAGCACCAGTGGAACTTGCA-3 端,引物合成由上海生物工程公司合成,擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為348 bp、214 bp。β-actin 上游引物:5 端-ACCACCATGTACACAGGCAT-3 端,下游引 物:5 端-CTCTCTTTGCACTCACTAGGGG-3 端,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為150 bp。
1.3 免疫組織化學(xué) SP 法:①脫蠟、水化;②PBS 洗2~3 次,各5 min;③3%二氧化氫滴加在切片上,室溫下放置10 min 左右;④PBS 洗2~3 次,各5 min;⑤微波爐中抗原修復(fù);⑥PBS 洗2~3 次,各5 min;⑦在每張病理切片中滴加適量的山羊血清封閉液,室溫放置19 min,甩去多余液體;⑧滴加相應(yīng)需要檢測的TP53或Wnt-5aⅠ抗50 μl,室溫環(huán)境下靜置1 h,4 ℃過夜或者37 ℃1 h;⑨4 ℃過夜后在37 ℃復(fù)溫45 min;⑩PBS 洗3 次,各5 min;每張切片中加入39~45 μlⅡ抗液,37 ℃條件下放置1 h;PBS 洗3 次,各5 min;DAB 液分別滴加D、A、B,5~10 min 后在顯微鏡下根據(jù)情況調(diào)整染色程度;PBS 或自來水沖洗10 min;染色結(jié)束后蘇木精復(fù)染3 min,后用鹽酸酒精分化;自來水沖洗10~15 min;脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化染色結(jié)果判定:TP53 定位主要位于細(xì)胞核以染色結(jié)果目的蛋白出現(xiàn)黃或棕色顆粒為陽性,陰性為陽性細(xì)胞<25%,陽性為陽性細(xì)胞>25%,隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)1000 個(gè)細(xì)胞。
1.4 反轉(zhuǎn)錄PCR 總RNA 提?。孩偃?00 mg 組織,放到1.5 ml EP 管中,在低溫條件下加入1 ml Trizol剪碎;②對EP 管中的組織震蕩30 s;③加入0.3 ml體積的氯仿,均勻充分搖動(dòng)30 s 左右,室溫下放置3 min;④8000×g,4 ℃離心,15 min;⑤吸掉上層無色水相,然后移入另一無菌EP 管中(約0.6 ml);⑥加等體積異丙醇,-20 ℃,30 min;⑦8000×g,4 ℃離心,10 min,在EP 管底部可見微量RNA 的沉淀;⑧去掉EP 管中上清液,加75%乙醇1 ml 后振蕩;⑨7500×g,4 ℃離心,10 min;⑩棄上清,用濾紙小心吸取殘留液體,室溫干燥5~10 min;沉淀溶于20 μl DEPC 水,取1 μl 加入79 μl DEPC 水測OD260/OD280;計(jì)算濃度與純度,-70 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反應(yīng)體系:氯化鎂、buffer、RNase-free dH2O、dntp、混合液、RNase 抑制劑、amv RNA transrciptase、random9 mers、positive control RNA 總體積10 μl,離心后反應(yīng)條件:30 ℃、41 ℃、95 ℃、5 ℃。PCR 反應(yīng):加入PCR 目的基因引物、模版cDNA、RNA tap 聚合酶、PCR buffer、滅菌蒸餾水,總反應(yīng)體積13 μl,混勻快速離心1 次,反應(yīng)條件:95 ℃、94 ℃、95 ℃、57 ℃、71 ℃、72℃,共35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物-20 ℃冰箱保存取PCR 產(chǎn)物8 μl 加5×Loading Buffer 2 μl 2%,通過110 V,95 mA 的電泳后,采用相應(yīng)的染色劑(溴化乙錠)對跑完后電泳的凝膠進(jìn)行著色,凝膠成象儀成象之后在電腦桌面上點(diǎn)擊并保存,通過密度分析軟件對測出各泳帶的吸光度值,以目的基因和βactin mRNA 吸光度比值進(jìn)行mRNA 半定量分析。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)資料進(jìn)行整理后錄入Excel 表格,采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以()表示,比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示,比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)性分析甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 的關(guān)系。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 TP53 蛋白、Wnt-5a 蛋白在甲狀腺癌與癌旁組織中的表達(dá) 甲狀腺癌TP53 陽性表達(dá)率為58.00%(29/50),高于癌旁組織的20.00%(2/10),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中甲狀腺癌中Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期TP53 陽性表達(dá)率分別為35.71%(5/14)、66.67%(24/36),二者比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。甲狀腺癌Wnt-5a 陽性表達(dá)率為40.00%(20/50),低于癌旁組的70.00%(7/10),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中甲狀腺癌中Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期Wnt-5a 陽性表達(dá)率分別為64.29%(9/14)、30.56%(11/36),二者比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。
圖1 TP53 在甲狀腺癌及癌旁組織中的表達(dá)
圖2 Wnt-5a 在甲狀腺癌及癌旁組織中的表達(dá)
2.2 TP53 mRNA、Wnt-5a mRNA 在甲狀腺癌與癌旁組織中的表達(dá)分析 甲狀腺癌TP53 mRNA 表達(dá)量為(0.54±0.040),高于癌旁組的(0.32±0.030),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中甲狀腺癌組Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期TP53 mRNA 表達(dá)量分別為(0.48±0.022)、(0.58±0.032),二者比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甲狀腺癌Wnt-5a mRNA 表達(dá)量為(0.51±0.079),低于癌旁組的(0.79±0.028),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中甲狀腺癌Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期Wnt-5a mRNA 表達(dá)量分別為(0.71±0.036)、(0.50±0.053),二者比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.3 甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 的關(guān)系Pearson 相關(guān)性分析顯示,甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 呈負(fù)相關(guān)(r=-0.720,P<0.05)。
P53 是一個(gè)癌癥抑制蛋白質(zhì),在腫瘤調(diào)控過程中以及人體代謝、發(fā)育過程中具有重要作用。目前TP53 在國內(nèi)的研究主要集中在卵巢癌,肺腺癌、肝癌、乳腺癌/三陰乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胃癌等惡性腫瘤中的蛋白表達(dá)特性,研究認(rèn)為[9-12],P53 和VEGF、P16、PAX2、PTEN、VHL、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原、細(xì)胞周期素、缺氧誘導(dǎo)因子-1α、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白、Mir-34 家族在腫瘤中協(xié)同表達(dá),導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞復(fù)雜的生物學(xué)特性,但是卻較少從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度研究P53 與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)系。有研究報(bào)道[13],TP53 對ID4 基因表達(dá)具有促進(jìn)作用。人類Wnt-5a轉(zhuǎn)錄并翻譯生成的成熟蛋白是人體生長發(fā)育和病理修復(fù)過程中的一個(gè)關(guān)鍵因子,并參與細(xì)胞變化調(diào)控,若Wnt-5a 異常變化則會導(dǎo)致細(xì)胞增殖特性改變,進(jìn)而出現(xiàn)增殖失控或增殖抑制。
本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)和RT-PCR 在蛋白和mRNA 層面檢測甲狀腺癌中的TP53 的表達(dá),結(jié)果顯示甲狀腺癌TP53 陽性表達(dá)率為58.00%(29/50),高于癌旁組織的20.00%(2/10),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中甲狀腺癌中Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期TP53 陽性表達(dá)率分別為35.71%(5/14)、66.67%(24/36),二者比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示高表達(dá)TP53 蛋白參與或者在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用。此外,甲狀腺癌TP53 mRNA 表達(dá)量為(0.54±0.040),高于癌旁組的(0.32±0.030),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中甲狀腺癌組Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期TP53 mRNA 表達(dá)量分別為(0.48±0.022)、(0.58±0.032),二者比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這種mRNA 表達(dá)的差異性與蛋白表達(dá)差異和模式相同,提示甲狀腺癌TP53 的異常增高在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)層面參與了腫瘤的進(jìn)展。
腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟多因素的過程,本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)和RT-PCR 檢測在甲狀腺癌中的Wnt-5a 的差異表達(dá),結(jié)果顯示甲狀腺癌Wnt-5a 陽性表達(dá)率為40.00%(20/50),低于癌旁組的70.00%(7/10),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中甲狀腺癌中Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期Wnt-5a 陽性表達(dá)率分別為64.29%(9/14)、30.56%(11/36),二者比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明Wnt-5a 在甲狀腺癌組的陽性表達(dá)率低于癌旁組陽性表達(dá)率以及隨甲狀腺癌的高分期,其總體陽性率較低。此外,甲狀腺癌Wnt-5a mRNA 表達(dá)量為(0.51±0.079),低于癌旁組的(0.79±0.028),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中甲狀腺癌Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期Wnt-5a mRNA 表達(dá)量分別為(0.71±0.036)、(0.50±0.053),二者比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且相關(guān)性分析顯示,甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 呈負(fù)相關(guān)(r=-0.720,P<0.05)。由于腫瘤分期越高往往提示腫瘤惡性程度以及侵襲性越高,這些結(jié)果顯示W(wǎng)nt-5a 在甲狀腺癌的發(fā)生過程中可能有抑制癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)細(xì)胞分化的作用。
綜上所述,TP53 和Wnt-5a 基因的表達(dá)參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展,同時(shí)Wnt-5a 激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在臨床甲狀腺癌的治療中具有輔助作用,二者聯(lián)合檢測對臨床手術(shù)方式、術(shù)后治療策略選擇、預(yù)后評估具有重要的價(jià)值。