侯柏龍，王 蔚，高雯潔

（1.嘉興市第一醫(yī)院檢驗科，浙江 嘉興 314000；2.嘉興市疾病預(yù)防控制中心，浙江 嘉興 314000）

腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis）是目前引起食物中毒的主要病原菌之一[1]，人類感染腸炎沙門菌后常出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等典型急性腸胃炎癥狀，少數(shù)人出現(xiàn)發(fā)熱。動物對該菌也同樣易感，尤其是被感染的家禽及其制成的家禽制品，由于它們攜帶腸炎沙門菌被人類食用而損害人類健康，甚至造成疫情暴發(fā)。對腸炎沙門菌進行同源性分析，可以追溯傳染源，及時采取措施控制疫情以及預(yù)防感染，同時為流行病學(xué)研究、食品安全、健康管理方面提供可靠的依據(jù)。脈沖場凝膠電泳（plused-field gel electrophoresis，PFGE）是目前國內(nèi)外普遍應(yīng)用于細菌分子分型的一種電泳技術(shù)，被譽為菌株同源性分析的金標準[2]，然而PFGE 方法比較繁瑣、耗時長、需要各實驗室間協(xié)調(diào)參數(shù)進行比較?；|(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)作為一種新型的電離質(zhì)譜技術(shù)，近年來發(fā)展快速并應(yīng)用于微生物的快速鑒定，其處理過程簡便快速，儀器自動化程度高，可以實現(xiàn)96 孔高通量分析，單次成本較低[3]，但是目前運用于菌株同源性分析研究的還較少。基于此，本研究運用PFGE 與MALDI-TOF MS兩種技術(shù)分別對11 株從臨床分離得到的腸炎沙門菌進行同源性分析，將兩種技術(shù)及其分析后的結(jié)果進行比較，進而分析其應(yīng)用價值，以期為疾病防治以及疫情防控提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集嘉興市第一醫(yī)院2018 年8 月～12 月患者的腸道標本分離培養(yǎng)沙門氏菌。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC8739 由法國梅里埃公司惠贈，分子質(zhì)量參考菌株：沙門氏菌國際標準菌株H9812，由浙江省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 試劑與儀器 乙腈；α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液CHCA；血平板（法國梅里埃）；木糖賴氨酸去氧膽酸鈉瓊脂平板（XLD）、改良磺綠增菌液（SBG）（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司），沙門屬60 種診斷血清（寧波天潤生物藥業(yè)有限公司），細菌基因組DNA提取試劑盒；內(nèi)切酶XbaⅠ（美國Promega）、蛋白酶K（德國MERCK），PFGE 專用瓊脂糖SeaKem Gold Agarose（美國Lonza）。CHEF Mapper 脈沖場凝膠電泳儀和GEL Doc EQ 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國DADE BEHRING）；VITEK MALDI_TOF MS 及VITEK-2 Compact 全自動微生物鑒定儀均購自法國梅里埃公司；力康Heal Force 生物安全柜HF safe 1500TE B2II（中國力康）；低溫冰箱（Haier，中國海爾）。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)蘇及鑒定 將收集的11 株菌株復(fù)蘇，涂血平板后于37 ℃培養(yǎng)24 h，分別調(diào)0.5 麥氏濁度，采用VITEK-2 Compact 儀器配套GN16 卡進行生化鑒定，并采用沙門菌屬診斷血清進行確認分型。

1.2.2 MALDI-TOF MS 菌種鑒定 采用MALDI-TOF MS SARAMIS 系統(tǒng)對上述菌株進行鑒定：①靶板清洗：用乙醇清洗靶板后待用；②點樣：在生物安全柜內(nèi)取經(jīng)18～24 h 培養(yǎng)菌落少量均勻涂于靶板，每個菌株涂1 孔，完全干燥后加CHCA 基質(zhì)液1 μl，待基質(zhì)液干燥后移出生物安全柜進行質(zhì)譜檢測。采用正線性模式，激光頻率60 Hz，加速電壓20 KV，離子源加速電壓167 KV、170 ns 離子延時引出，質(zhì)譜區(qū)間設(shè)定的質(zhì)核比（M/Z）為2000～20000 Da，質(zhì)控品為大腸埃希菌ATCC8739，采用VITEK MALDI-TOF MS IVD3.0 版本進行結(jié)果比對，檢測結(jié)果以成功鑒定為沙門氏菌即可滿足要求。

1.2.3 MALDI-TOF MS 分型與質(zhì)譜圖的分析比較 在SARAMIS 數(shù)據(jù)庫界面，導(dǎo)入需進行同源性分析的11株菌，Lanchpad 軟件導(dǎo)出屬于同一型的腸炎沙門菌的質(zhì)譜圖，進行同源性分析，并形成同源性圖譜。

1.2.4 PFGE 分型 根據(jù)沙門氏菌脈沖場凝膠電泳標準操作規(guī)程進行：①細菌的包埋；②細菌的裂解；③清洗膠塊；④膠塊內(nèi)DNA 的酶切；⑤加樣和電泳；⑥圖像獲?。虎邤?shù)據(jù)分析。用Xba 1 內(nèi)切酶在37 ℃下酶切4 h，然后上機電泳，分子量30～700 K，初始轉(zhuǎn)換時間2.16 s，終末轉(zhuǎn)換時間63.8 s，電壓梯度6 V/cm，夾角120°，線性，電泳起始電流140 mA。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 將獲得的11 株腸炎沙門菌的PFGE 圖譜用BioNumerics 6.6 軟件分析，并使用非加權(quán)配對算術(shù)平均法進行聚類分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果 收集得到的11 株菌株經(jīng)法國生物梅里埃公司VITEK 2compact 全自動微生物分析儀鑒定為沙門菌屬歷時約228 min，而MALDI-TOF MS 鑒定只需8 min，二者比較，差異統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且鑒定結(jié)果全部正確，見圖1。血清凝集試驗結(jié)果：A～F 多價O 抗血清：（+），O 因子O1：（+）、O9：（+）、O12：（+），H 因子Hg：（+）、Hm：（+），鹽水對照：（-）符合腸炎沙門菌血清型。

圖1 兩種方法鑒定腸炎沙門菌時間比較

2.2 菌株分型結(jié)果

2.2.1 MALDI-TOF MS 分型結(jié)果 以相對相似度＞80%為同一型的分型方法，MALDI-TOF MS 分型共分為MS1 型與MS2 型，其中MS1 型占90.91%（10/11）、MS2 型占9.09%（1/11），分型集中于MS1，見圖2。

圖2 11 株腸炎沙門菌MALDI-TOF MS 分型結(jié)果

2.2.2 PFGE 分型結(jié)果 11 株腸炎沙門菌經(jīng)酶切處理后上機電泳，得到PFGE 圖譜進行同源性分析，結(jié)果顯示菌株相似度在93%～100%。根據(jù)聚類相似度＞95%為同一亞型的分型標準，可以將11 株菌株分為E1 型和E2 型，其中E1 型占81.82%（9/11），E2 型占18.18%（2/11），分型集中于E1 型，見圖3。

圖3 11 株腸炎沙門菌PFGE 分型結(jié)果

3 討論

沙門氏菌是一類寄居于人類或動物腸道內(nèi)的革蘭陰性桿菌，在自然界中常見，主要引起人類傷寒、副傷寒、急性腸胃炎、敗血癥、局部感染等疾病，其中腸炎沙門氏菌主要引起人類食物中毒[4]。而我國引起食物中毒的原因中尤以細菌性食物中毒高發(fā)，占各種食物中毒類型的34.84%[5]，因此，快速準確地鑒定沙門氏菌并明確其分型對臨床診療和感染預(yù)防均有重要意義。

研究表明[6]，MALDI-TOF MS 鑒定可信度達＞80%，結(jié)果較為準確。本研究中利用MALDI-TOF MS與微生物自動生化鑒定系統(tǒng)VITEK 2 分別檢測11株腸炎沙門菌，兩者得到的檢測結(jié)果完全一致，MALDI-TOF MS 檢測所需的時間僅為VITEK 2 的1/29，而且對于MAC 平板、SS 平板和HE 平板等常用的選擇性培養(yǎng)基上生長的沙門菌菌株，MALDI-TOF MS均能得到準確的鑒定結(jié)果。細菌同源性分析有助于疾病預(yù)防部門系統(tǒng)地開展溯源分析及分子流行病學(xué)研究，而PFGE 是目前實現(xiàn)這一目標的可靠方法，但其實驗繁瑣、耗時長，臨床難以常規(guī)開展。本研究選取了11 株從臨床患者大便標本分離得到的腸炎沙門菌，利用MALDI-TOF MS 得到分型結(jié)果進行聚類分析，然后與“金標準”的PFGE 分型結(jié)果相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者分型結(jié)果相似度達73%，提示MALDI-TOF MS用于腸炎沙門菌同源性分析僅可以做參考，準確結(jié)果目前仍需要借助PFGE 技術(shù)來得到。但有研究顯示[7]，MALDI-TOF MS 可對肺炎克雷伯菌進行同源性分析，結(jié)果可靠。有研究顯示[8]，該技術(shù)運用于鮑曼不動桿菌、鼠傷寒沙門菌等的同源性分析時同樣具有快速、高通量的優(yōu)點。另有研究表明[9]，將臨床菌株質(zhì)譜數(shù)據(jù)補充至質(zhì)譜儀鑒定數(shù)據(jù)庫，可以增加MALDITOF MS 對沙門菌的分型鑒定能力。本研究中MALDI-TOF MS 對11 株腸炎沙門氏菌同源性分析結(jié)果與PFGE 有差異，可能與本實驗所用的菌株數(shù)量過少出現(xiàn)偶然性有關(guān)，需要進一步豐富采集的腸炎沙門菌數(shù)量進行實驗；也可能是由于血清學(xué)方法是根據(jù)細菌的抗原差異來區(qū)分類型，而MALDI-TOF MS 是通過檢測細菌菌體核糖體蛋白質(zhì)來區(qū)分類型，同一種菌株的不同菌體之間表面的組成分布不完全相同，因為細菌的遺傳狀態(tài)、基質(zhì)選擇、培養(yǎng)條件及抗生素使用所導(dǎo)致耐藥譜的不同均會影響菌株的蛋白表達，進而造成分型確定的不穩(wěn)定性[9]。

綜上所述，MALDI-TOF MS 技術(shù)用于快速鑒定沙門氏菌，結(jié)果可靠。MALDI-TOF MS 技術(shù)可以作為腸炎沙門菌同源性分析方法的參考，為疾病防治以及疫情防控提供寶貴的時間差。但暫時還不能完全代替PFGE 方法作為同源性分析的金標準，日后將增加實驗菌株數(shù)目繼續(xù)實驗以及進一步完善MALDI-TOF MS 比對數(shù)據(jù)庫。