(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室呼和浩特 010018)

0 引 言

益生菌作為一類活性微生物，會(huì)對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生有益的作用，因?yàn)槿槭且嫔己玫谋Ｗo(hù)性載體，同時(shí)在乳發(fā)酵過程中益生菌也會(huì)產(chǎn)生大量對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)成分，因此近些年來以益生菌為代表的發(fā)酵乳制品受到越來越多人的關(guān)注。在制作發(fā)酵乳制品過程中，益生菌發(fā)酵劑的活性對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量及其益生功能產(chǎn)生重要影響。目前根據(jù)發(fā)酵劑的制備方式可分為：液態(tài)發(fā)酵劑、冷凍發(fā)酵劑和干燥發(fā)酵劑三類[1]，其中因干燥發(fā)酵劑具有易于貯藏和使用方便等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。干燥發(fā)酵劑的制備主要依賴于干燥技術(shù)（Drying technology），盡可能將菌粉的含水量降到最低，使菌株處于休眠狀態(tài)以延長(zhǎng)貯藏期[2]?，F(xiàn)如今應(yīng)用廣泛的干燥技術(shù)主要為：真空冷凍干燥、噴霧干燥、鼓風(fēng)干燥、流化床干燥等，但在食品工業(yè)中主要以真空冷凍干燥和噴霧干燥為主。

真空冷凍干燥技術(shù)是將細(xì)菌細(xì)胞懸浮液冷凍至低溫狀態(tài)，在真空條件下由冰升華為水蒸氣，除去菌液中的水分，進(jìn)而使菌體成為凍干粉狀態(tài)[3]。由于物料溫度被控制在冰點(diǎn)以下，因此微生物遭受的熱脅迫、氧化脅迫等均為最小，處理后的菌株活菌數(shù)相對(duì)較高且能較好的保留菌株中的活性物質(zhì)，但這種技術(shù)成本相對(duì)較高且因冷凍造成的冰晶及干燥過程的脫水，會(huì)使得益生菌受到傷害，進(jìn)而影響菌株存活率[4]。噴霧干燥技術(shù)是指菌體濃縮液經(jīng)噴霧干燥分散于熱空氣中，料液水分快速蒸發(fā)形成固體粉末的過程，此法用時(shí)較短、制粉迅速、可使料液由液態(tài)經(jīng)霧化和干燥直接變成為固體粉末，具有生產(chǎn)能力高，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[5]，但在快速脫水時(shí)以及高氣流溫度會(huì)對(duì)菌株造成熱脅迫、脫水脅迫及氧化脅迫等不可避免的損傷[6]。大量研究證明冷凍干燥及噴霧干燥會(huì)對(duì)益生菌的生理機(jī)制造成一定程度上的損傷，并提出了相應(yīng)的解決辦法，但缺乏對(duì)兩種不同干燥方式下影響益生菌活性的主要因素進(jìn)行系統(tǒng)地對(duì)比分析。因此本文將從菌株自身特性、菌株培養(yǎng)基成分、制備工藝及保護(hù)措施等方面分析不同干燥方式下影響菌株活性的主要因素，為選擇合理的益生菌發(fā)酵劑制備方法及減少制備過程中對(duì)益生菌的傷害提供一些理論參考。

1 菌株自身特性

制備益生菌發(fā)酵劑不僅要求菌株具有良好的發(fā)酵性能及較弱的后酸化能力，同時(shí)也應(yīng)具有抵抗不良環(huán)境的能力。從菌株自身特性出發(fā)，在干燥過程中其菌株存活率與菌體遺傳物質(zhì)、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)及菌體酶活等息息相關(guān)。

盡管有些特定的菌株由于內(nèi)在基因的關(guān)系對(duì)冷凍干燥特別敏感，但絕大多數(shù)益生菌還是具有抗冷凍性的[7]，而原核生物的遺傳物質(zhì)均是以蛋白質(zhì)包裹DNA的復(fù)合形式存在，冷凍干燥過程中由于冰結(jié)晶及脫水引起電荷的變化和空間結(jié)構(gòu)的改變都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，進(jìn)而引起DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降，遺傳物質(zhì)受到破壞，因此DNA修復(fù)酶會(huì)對(duì)菌株的抗冷凍干燥性起到很大影響。田中吉紀(jì)等對(duì)大腸桿菌（E.Coli）Bs-1（放射敏感性菌株，缺乏修復(fù)酶）與E.Coli B/r（放射性抵抗株，具有修復(fù)酶）菌株培養(yǎng)之后進(jìn)行冷凍干燥，發(fā)現(xiàn)兩者的存活率分別為0.23%和53%，這就說明具有DNA修復(fù)酶的菌株能夠修復(fù)冷凍干燥帶來的DNA損傷，恢復(fù)菌株繁殖能力，因而其抗凍性較強(qiáng)[8]。此外，菌體的抗冷凍干燥性能也會(huì)受到膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸含量的影響，其中不飽和脂肪酸熔點(diǎn)低，有利于保持菌株細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使菌株保持活性，因此選擇細(xì)胞膜不飽和脂肪酸相對(duì)含量高的菌株有利于提高冷凍干燥存活率，趙文英等研究ATB培養(yǎng)基培養(yǎng)所得酒球菌，與FMATB和MATB培養(yǎng)基相比，菌株細(xì)胞膜不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比值，即U:S提高分別提高了20.4%和45.2%，增強(qiáng)了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高了對(duì)冷凍干燥的抗性[9]。近些年來研究發(fā)現(xiàn)菌株細(xì)胞形態(tài)對(duì)其抗冷凍干燥性能具有重要作用，一般來說球菌的抗性優(yōu)于桿菌，Tripathi等發(fā)現(xiàn)形狀呈小球型的球菌比長(zhǎng)桿狀的桿菌對(duì)冷凍干燥具有更強(qiáng)的抵抗力，短棒狀桿菌比長(zhǎng)纖細(xì)狀桿菌對(duì)冷凍干燥的抵抗力強(qiáng)[10]，這是因?yàn)榫晗鄬?duì)較小的比表面積在冷凍過程中可以有效地降低冰晶對(duì)菌株細(xì)胞膜造成的機(jī)械損傷，但Selmer等人卻發(fā)現(xiàn)在相同的凍干條件下，明串珠菌（Leuconostoc）的活力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于桿菌，這表明菌株對(duì)冷凍干燥的抗性不僅僅與比表面積有關(guān)，還有可能取決于本身細(xì)胞膜脂肪酸成分，因?yàn)閷?duì)桿菌細(xì)胞膜脂肪酸的測(cè)定表明不飽和脂肪酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于明串珠菌，因而其抗凍性較強(qiáng)[11]。綜上所述：在冷凍干燥過程中，菌株內(nèi)部遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性及DNA修復(fù)酶的活性等菌株自身特性對(duì)其抗冷凍性能起到非常重要的作用，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)、菌株不飽和脂肪酸含量也會(huì)產(chǎn)生一定影響。

與冷凍干燥不同，在噴霧干燥過程中菌株形態(tài)對(duì)其自身抗熱性影響不大，但與菌體關(guān)鍵酶活性、細(xì)胞遺傳物質(zhì)及菌株抗氧化能力等密切關(guān)聯(lián)。Song和Schuck通過對(duì)比乳球菌、乳桿菌、雙歧桿菌以及丙酸桿菌，發(fā)現(xiàn)耐熱性更好的丙酸桿菌的干燥存活率最高[12-13]，由此可見在噴霧干燥過程中細(xì)胞存活率和細(xì)菌形態(tài)并無太大關(guān)系，而取決于菌體自身抗熱性能，進(jìn)一步的研究表明不同菌株間存在差異性的原因可能是在高溫環(huán)境中菌體內(nèi)關(guān)鍵酶的失活程度不同，如β-半乳糖苷酶、己糖激酶及乳酸脫氫酶等，而益生菌的抗逆性直接受其活性的影響，例如，乳酸脫氫酶可在細(xì)胞膜的脂肪酸鏈中引入雙鍵提高脂肪酸的不飽和度造成膜脂熔點(diǎn)的降低，使得細(xì)胞膜流動(dòng)性升高，防止了脫水干燥造成的細(xì)胞膜損傷，但在高溫環(huán)境中，如果乳酸脫氫酶的活性降低，會(huì)導(dǎo)致不飽和脂肪酸含量降低，膜的流動(dòng)性下降，菌株受到傷害[14]。研究還嘗試通過菌株遺傳物質(zhì)中G-C的比例來探究菌株與其耐熱性的關(guān)系，Brock等發(fā)現(xiàn)在70℃以上生長(zhǎng)的嗜熱高溫菌（Thermophilic），其基因組中G-C含量高達(dá)67%，推測(cè)菌株基因組DNA解鏈溫度取決于A-T堿基和G-C堿基對(duì)的比例，因?yàn)镚-C堿基對(duì)氫鍵比例高、鍵能強(qiáng)，DNA熱穩(wěn)定性強(qiáng)，不容易受到破壞[15]。此外噴霧干燥過程雖能夠快速除去料液中的水分，但環(huán)境氧氣濃度相對(duì)較高，在高氧環(huán)境下，菌株產(chǎn)生大量自由基并在細(xì)胞內(nèi)積聚，如果菌株缺乏相應(yīng)的抗氧化能力，這些自由基將與菌株內(nèi)氨基酸，脂質(zhì)和核酸等發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)及核酸受到破壞。Annereinou等對(duì)從不同地區(qū)分離的39株乳酸乳球菌在經(jīng)噴霧干燥后菌株的熱抗性及氧化抗性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)熱和氧均具有抗性的菌株為：Lactococcus lactis MG1363，Lactococcus lactis LMG14418和Lactococcus lactis NCDO 895，且在噴霧干燥過程中的存活率比對(duì)熱和氧氣敏感的菌株Lactococcus lactis SK11、Lactococcus lactis AM 2和Lactococcus lactis LMG8526）高出200倍以上[16]。因此選取具有較高抗氧化活性的菌株，能夠有效避免高濃度氧環(huán)境帶來的氧化脅迫反應(yīng)，減輕自由基對(duì)菌株造成的損傷，提高菌株的存活率。綜上所述：在噴霧干燥過程中，菌體關(guān)鍵酶活性、遺傳物質(zhì)在高溫環(huán)境中的穩(wěn)定性、抗氧化性，均能顯著影響到菌株在噴霧干燥過程中的存活率。

2 培養(yǎng)基成分

作為菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的碳源和氮源對(duì)菌體的抗冷凍干燥性能起到重要作用，通過研究MRS培養(yǎng)基中不同碳源對(duì)保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）凍干存活率的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用葡萄糖、果糖、乳糖和甘露糖分別代替原始M RS中的碳源物質(zhì)時(shí)，甘露糖的效果最好，凍干存活率最高[17]，原因在于德氏乳桿菌保加利亞亞種利用培養(yǎng)基中的甘露糖轉(zhuǎn)化為部分甘露醇并保留在細(xì)胞內(nèi)，在干燥細(xì)胞脫水過程中，甘露醇作為相容性物質(zhì)維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，對(duì)菌株起到保護(hù)作用。Chen等研究不同培養(yǎng)基成分對(duì)菌株Lactobacillus bulgaricus LB6的冷凍存活率的影響，結(jié)果表明添加海藻糖使菌株的冷凍存活率提高，原因可能是菌體吸入海藻糖后細(xì)胞內(nèi)的DNA、核糖體等大分子的穩(wěn)定性增強(qiáng)從而提高菌株的抗冷凍干燥能力[18]。邵玉宇等研究不同類型氮源對(duì)菌株Lactobacillus bulgaricus ND02冷凍干燥存活率的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在培養(yǎng)基中額外添加4%酵母浸膏時(shí)，菌株冷凍干燥存活率反而下降了12%，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)菌體長(zhǎng)度增加1倍，因此由于菌株比表面積的增加可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜機(jī)械損傷的增大，從而使得菌株死亡率增高，可見氮源類型會(huì)影響其菌體形態(tài)[19]。以上研究說明培養(yǎng)基中不同類型的碳源及氮源均會(huì)影響到菌株對(duì)冷凍干燥的抗性。

對(duì)于噴霧干燥，當(dāng)培養(yǎng)基成分選擇乳糖和胰蛋白胨分別做為菌株碳源及氮源時(shí)，菌株的抗性存活率有所提高。Carvalho等研究了不同碳源培養(yǎng)基對(duì)菌株耐熱性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳糖為碳源的培養(yǎng)基可以培育出耐熱性較好的菌株[20]；HUANG等對(duì)干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）噴霧干燥存活率影響因素的研究中發(fā)現(xiàn)添加高乳糖含量的甜乳清(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)，可使得菌株的存活率提高到100%[21]；此外氮源也會(huì)影響菌株噴霧干燥存活率，胡榴榴等對(duì)干酪乳桿菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1%的大豆蛋白胨、魚粉、胰蛋白胨時(shí)，胰蛋白胨作為菌株氮源培養(yǎng)基，其活菌數(shù)最高為9.5 lgCFU/mL，在此基礎(chǔ)上添加10%脫脂乳保護(hù)劑，其干燥存活率為63.9%[22]。綜合以上結(jié)果說明分別使用乳糖和胰蛋白胨作為菌株碳源和氮源生長(zhǎng)培養(yǎng)基時(shí)，菌株增殖效果好且抗熱性較強(qiáng)。

3 制備工藝

在冷凍干燥過程中，細(xì)胞死亡的主要原因是由于菌株內(nèi)外冰晶的形成導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜受到機(jī)械損傷。慢速凍結(jié)是指細(xì)胞懸液以1℃/min的速度降溫至零下20～40℃。當(dāng)凍結(jié)速率較低時(shí)，細(xì)胞游離水在胞外形成冰晶，胞內(nèi)外存在化學(xué)勢(shì)差異，使得胞內(nèi)水分外滲到胞外，并在細(xì)胞外形成大的冰晶，與此同時(shí)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高，造成細(xì)胞蛋白損傷及細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，產(chǎn)生“溶質(zhì)損傷”；相反快速凍結(jié)是指細(xì)胞懸液以10℃/min以上的速度降溫，短時(shí)間即可完成凍結(jié)，此方式胞內(nèi)失水較慢，從而形成較大的冰晶造成菌體細(xì)胞的機(jī)械損傷。于金迪等通過乳酸菌研究?jī)鼋Y(jié)速率的快慢對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：快速凍結(jié)(76℃/min)的效果優(yōu)于慢凍(0.4℃/min)；然而也有針對(duì)保加利亞乳桿菌進(jìn)行凍干實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用速凍(60℃/min)菌株存活率低于慢凍(1℃/min)[23]。這表明凍結(jié)速率與菌株特異性有關(guān)，利用最適凍結(jié)速度進(jìn)行冷凍時(shí)，雖然菌體細(xì)胞內(nèi)的水分會(huì)滲透到細(xì)胞外，但細(xì)胞體積收縮較小，對(duì)細(xì)胞的活性不會(huì)造成太大影響；而產(chǎn)品共熔點(diǎn)決定其凍結(jié)溫度，若高于共熔點(diǎn)，未完全凍結(jié)的樣品液體迅速蒸發(fā)，樣品收縮；若低于共熔點(diǎn)，會(huì)造成能源浪費(fèi)，同時(shí)會(huì)使菌株存活率降低，因此選擇低于共熔點(diǎn)10～20℃為合適凍結(jié)溫度[24]。綜上所述：凍結(jié)速率和凍結(jié)溫度均會(huì)對(duì)細(xì)菌冷凍干燥存活率產(chǎn)生較大影響，利用適合菌株的凍結(jié)速率和凍結(jié)溫度進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，會(huì)提高菌株的干燥存活率。

在噴霧干燥過程中，高溫環(huán)境會(huì)造成菌株脫水失活及熱失活，為了降低細(xì)菌的這種損傷，可以通過調(diào)控進(jìn)出口溫度，提高菌株的噴霧干燥存活率。研究表明高出口溫度對(duì)益生菌的存活具有負(fù)面影響，因而在保證低水分的前提下，噴霧干燥的出口溫度越低越有利，見表1。Wanticha等研究出口溫度對(duì)菌株存活率時(shí)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)噴霧干燥出口溫度是65℃時(shí)，植物乳桿菌（Lb.pseudo-plantarum）UL137的存活率為40%，在提高出口溫度的情況下（進(jìn)口溫度180℃，出口溫度75℃），乳桿菌的存活率僅為14.7%[25]。在噴霧干燥過程中，菌體細(xì)胞溫度變化分為兩個(gè)階段：在干燥速率恒定時(shí)期，菌體的存活率取決于濕球溫度，此時(shí)噴霧塔內(nèi)料液水分快速蒸發(fā)帶走熱量，菌株的存活率與出口溫度密切相關(guān)與入口溫度并與太大關(guān)系，此期間干燥時(shí)間極短，約幾分之一秒，甚至幾十分之一秒，物料表面溫度約45℃，因此此階段對(duì)菌體造成的損傷是有限的；在降速干燥速率期間，菌粉顆粒表面變干，固形物熱阻較大，水分轉(zhuǎn)移阻力增大，所以干燥時(shí)間較長(zhǎng)，一般需20～30 s，此時(shí)粉末最高溫度和干燥塔空氣溫度相同，一般約80～100℃，這時(shí)菌體的熱失活不僅取決于出口溫度，還與干燥時(shí)間有關(guān)，而且細(xì)胞的失活主要發(fā)生在此階段，升高入口溫度會(huì)降低菌體的存活率[26]。除脫水失活以外，在高溫過程中還有可能對(duì)菌株造成熱失活，Peighambardoust等人提出高溫環(huán)境會(huì)使胞內(nèi)核糖體、胞內(nèi)大分子（DNA、RNA和蛋白質(zhì)）及細(xì)胞膜發(fā)生傷害，但熱失活對(duì)菌株造成最大的傷害仍來自于核糖體的功能的喪失[27]。因此高溫會(huì)對(duì)菌株造成一定損傷，適當(dāng)降低出口溫度更有利于提高其干燥存活率。

4 提高菌株存活率的措施

冷凍干燥和噴霧干燥過程均會(huì)不可避免的給菌株造成傷害，影響其干燥存活率，為了提高菌株的干燥存活率，一方面通過不同溫度對(duì)其進(jìn)行馴化處理，這不僅能夠改變細(xì)菌細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量，還將促使菌株發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激蛋白，提高細(xì)菌抗干燥性能，另一方面還可以通過添加保護(hù)劑的方法保護(hù)菌株免受損傷，提高其干燥存活率。

表1 不同因素對(duì)菌株噴霧干燥存活率的影響

4.1 溫度馴化

采用冷脅迫的方法一方面可以使菌體產(chǎn)生應(yīng)激蛋白(Cold Shock Protein，CSP)，可降低冷凍干燥過程帶來的損傷，進(jìn)一步提高其對(duì)于冷凍的耐受能力；另一方面在低溫誘導(dǎo)過程中，乳酸菌內(nèi)不飽和脂肪酸的比例會(huì)隨溫度降低而增加，有效避免細(xì)胞內(nèi)凝膠的形成，保持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，進(jìn)而使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)[34]，因此低溫誘導(dǎo)下不飽和脂肪酸比例的增加，對(duì)細(xì)胞膜發(fā)揮正常功能至關(guān)重要。Beales等將嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）CNRZ 302在20℃分別預(yù)冷處理2 h和4 h后,其凍干存活率相比于對(duì)照組提高了10倍和100倍[25]；李夢(mèng)洋等通過PCR克隆及SDS-PAGE電泳等技術(shù)，采用較低溫度對(duì)保加利亞乳桿菌中冷應(yīng)激蛋白基因Csp A進(jìn)行分析，結(jié)果表明：20℃、2 h的低溫培養(yǎng)使得菌株中冷應(yīng)激蛋白Csp A基因的mRNA拷貝數(shù)增加3倍左右，并發(fā)現(xiàn)兩種7 ku的冷應(yīng)激蛋白，菌體抗凍性顯著提高[35]；Murga等研究不同溫度對(duì)嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CRL640抗冷凍性能的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)溫度較低時(shí)（25℃），細(xì)胞膜中十八碳二烯酸的含量是37℃培養(yǎng)時(shí)的3倍，菌株具有比較高的抗冷凍能力[36]；此外Li等研究冷應(yīng)激處理對(duì)保加利亞乳桿菌中環(huán)丙烷脂肪酸（CFA）和凍干存活率影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在冷應(yīng)激條件下乳酸菌凍干耐受性增強(qiáng)，其CFA含量均有不同程度的提高[37]。以上現(xiàn)象說明：低溫誘導(dǎo)有利于菌株產(chǎn)生冷應(yīng)激蛋白，從而增強(qiáng)益生菌株的抗凍能力；同時(shí)經(jīng)過預(yù)冷處理的菌株,細(xì)菌細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量高，增強(qiáng)了菌株的抗冷凍干燥性能。

通過熱激反應(yīng)使得菌產(chǎn)生一系列熱激蛋白（Heat Shock Protein,HSP），可增強(qiáng)菌株在高溫環(huán)境下對(duì)熱的抵抗能力，從而最大限度的保護(hù)菌體免受損傷。張書猛等采用通過熱激的方法提高Lactobacillus bulgaricus和Lactobacillus的抗熱能力，將菌株在45℃和50℃的溫度下分別培養(yǎng)1 h，之后進(jìn)行80℃5 min的熱處理，此時(shí)活菌數(shù)較處理前增加一個(gè)數(shù)量級(jí)[38]；Khem等對(duì)副干酪乳桿菌（L.paracasei）進(jìn)行熱激研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將菌株在52℃處理15 min后，所得菌體在60℃熱處理過程中的存活率可以提升30～70倍，而在噴霧干燥后的活性可以提升18倍[39]；陸英等研究熱激條件對(duì)干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）BD-Ⅱ耐熱性的影響，結(jié)果表明合適的熱激條件處理可提高菌株的耐熱性，且菌株的最佳熱激條件為：菌齡7 h時(shí)、50℃熱激45 min，相比處理前提高2.11倍[40]；在此基礎(chǔ)上，通過動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)菌株熱激后立即誘導(dǎo)產(chǎn)生的是熱激蛋白DnaK和GroEL，顯著快于其他類型蛋白；Gouesbet等通過蛋白組學(xué)對(duì)比菌株在熱激下蛋白的改變，發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacil-lus delbrueckii subsp.bulgaricus)和其熱突變株在熱激下都能誘導(dǎo)產(chǎn)生熱激蛋白，但是經(jīng)過熱突變菌株誘導(dǎo)蛋白的速度更快，且能持續(xù)大量表達(dá)，使突變株抗熱性更強(qiáng)[41]。以上研究表明：經(jīng)過適當(dāng)強(qiáng)度的熱刺激，會(huì)誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生相應(yīng)應(yīng)激蛋白，能夠有效增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)高溫環(huán)境的耐受能力，還可以通過熱突變的方式使菌株產(chǎn)生應(yīng)激蛋白的速度更快，更加有效增強(qiáng)菌株抗熱性能。

4.2 添加保護(hù)劑

添加保護(hù)劑是菌體在干燥和儲(chǔ)存期間保持活性最有效的方法之一。益生菌保護(hù)劑按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為：甘露糖、海藻糖等糖類及脫脂乳、全脂乳等蛋白兩大類，食品工業(yè)中常用的保護(hù)劑主要以海藻糖和脫脂乳為主[31,40]。

4.2.1 冷凍干燥保護(hù)劑

有研究表明二糖適合用作菌株凍干保護(hù)劑，在冷凍干燥過程中，海藻糖和蔗糖等二糖相比于單糖和多糖來說，對(duì)菌株保護(hù)效果較好[42]。Costa等人研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)使用5 g/100 mL的海藻糖作保護(hù)劑時(shí)，成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)菌株的存活率為83%，當(dāng)使用10 g/100 mL的蔗糖時(shí)，菌株存活率接近75%[43]，進(jìn)一步研究顯示，利用脫脂乳及甘油等成分與上述糖類進(jìn)行復(fù)配時(shí)，細(xì)菌凍干效果會(huì)更好，研究不同保護(hù)劑對(duì)乳酸桿菌乳脂亞種KLDS4.0326冷凍干燥存活率發(fā)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，脫脂乳、海藻糖及甘油等復(fù)配保護(hù)劑的效果要優(yōu)于單一保護(hù)劑，其存活率可達(dá)87.4%。原因可能是：糖類中雙糖作為保護(hù)劑具有一定優(yōu)勢(shì)，一方面體現(xiàn)在它們的玻璃轉(zhuǎn)化溫度較高，能夠通過磷脂雙分子層表面，磷酸與糖的羥基相互作用，代替細(xì)胞內(nèi)極性殘基周圍的水（即水置換假設(shè)，見圖1），降低膜相轉(zhuǎn)變溫度，進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成[44-45]；另一方面糖類分子內(nèi)含有多個(gè)羥基，可通過氫鍵與菌體細(xì)胞膜磷脂或蛋白質(zhì)結(jié)合，起到穩(wěn)定磷脂雙分子層和膜蛋白結(jié)構(gòu)的作用，保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷；此外復(fù)配保護(hù)劑脫脂乳中乳蛋白能在菌體外形成蛋白膜，固定凍干酶類，有效防止細(xì)胞壁蛋白質(zhì)損傷所引起胞內(nèi)物質(zhì)的泄露，且甘油具有良好的滲透能力，可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與胞內(nèi)大分子形成氫鍵，取代干燥過程中失去的水分，從而維持蛋白質(zhì)、碳水化合物等活性物質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)，提高細(xì)菌的凍干存活率[46]。綜上所述：糖類物質(zhì)適合用于菌株冷凍干燥保護(hù)劑，當(dāng)與脫脂乳及其他成分復(fù)配使用時(shí)菌株抗凍性效果會(huì)更好。

圖1 細(xì)胞菌株脫水時(shí)海藻糖的“水替代”保護(hù)作用機(jī)理圖[46]

4.2.2 噴霧干燥保護(hù)劑

與冷凍干燥相比，噴霧干燥保護(hù)劑中脫脂乳起到非常關(guān)鍵的作用，脫脂乳中的蛋白質(zhì)可以穩(wěn)定細(xì)胞膜成分來免受高溫?fù)p傷，其中的鈣離子能夠在熱處理過程中引起乳蛋白聚集而保護(hù)細(xì)菌，因而是被研究最為深入的一種菌株保護(hù)劑，熊濤等在研究植物乳桿菌NCU 116的噴霧干燥效果時(shí)，發(fā)現(xiàn)利用脫脂乳當(dāng)做菌株保護(hù)劑時(shí)，菌株存活率達(dá)到69.5%，效果優(yōu)于海藻糖和谷氨酸鈉[47]。另外脫脂乳濃度也會(huì)影響菌株的干燥存活率，Espina和Ananta等發(fā)現(xiàn)在噴霧干燥過程中，利用25%脫脂乳作為嗜酸乳桿菌保護(hù)劑時(shí)，其干燥存活率高于使用40%脫脂乳的菌株存活率，Ananta等認(rèn)為對(duì)于不同類型的乳酸菌菌株，當(dāng)脫脂濃度為20%時(shí)，菌株均具有最好的抗熱性能[48]。進(jìn)一步研究表明，利用明膠、阿拉伯膠及可溶性淀粉類與脫脂乳進(jìn)行復(fù)配使用，可提高菌株存活率，Khem等研究表明，同時(shí)使用脫脂乳和阿拉伯膠用作干燥保護(hù)劑，可以提高噴霧干燥的乳雙歧桿菌BB12的存活率[49]；研究還發(fā)現(xiàn)，若單獨(dú)使用聚右旋糖或菊粉作為保護(hù)劑，噴霧干燥后的乳酸菌的存活率并不高，但當(dāng)脫脂乳和聚右旋糖，或脫脂乳和菊粉復(fù)配使用，則能提高干燥后和儲(chǔ)藏過程中乳酸菌的存活率，達(dá)到85.8%[50]。原因可能是：脫脂乳中乳清蛋白分子中的疏水基團(tuán)與菌體表面間存在疏水作用，使蛋白質(zhì)分子緊密包裹于細(xì)胞表面并形成蛋白膜，在干燥過程中會(huì)較早成殼，減少菌體胞壁破損而引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外露，有利于保護(hù)益生菌的活性[51]，此外若載體介質(zhì)固體含量較高，會(huì)導(dǎo)致較長(zhǎng)的干燥時(shí)間，菌株會(huì)受到更多的熱損傷，相反隨著載體中脫脂乳固體含量的降低，噴霧干燥后菌株儲(chǔ)存穩(wěn)定性下降，因此脫脂乳濃度應(yīng)保證菌株在脫水過程中免受損傷的同時(shí)，還應(yīng)考慮其貯藏穩(wěn)定性；另外類似阿拉伯膠、聚右旋糖及菊粉等多糖類物質(zhì)是多羥基化合物，可通過氫鍵與菌體細(xì)胞膜磷脂結(jié)合，在噴霧干燥過程中起到保護(hù)細(xì)胞膜及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。綜上所述：脫脂乳非常適合用做菌株噴霧干燥保護(hù)劑，與多糖類物質(zhì)進(jìn)行復(fù)配使用時(shí)，菌株抗干燥性能會(huì)得到進(jìn)一步提高。

5 小 結(jié)

冷凍干燥和噴霧干燥技術(shù)常被應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑制備過程中，但二者均會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞造成損傷影響其活性。本文從益生菌株自身特性、菌株培養(yǎng)條件、制備工藝及保護(hù)措施等方面，系統(tǒng)的分析了冷凍干燥和噴霧干燥技術(shù)對(duì)益生菌發(fā)酵劑造成的影響，并提出相應(yīng)保護(hù)措施。在冷凍干燥過程中，菌株細(xì)胞損傷主要來自于冰晶對(duì)菌株細(xì)胞膜的破壞，菌株抗凍性主要取決于菌株自身DNA穩(wěn)定性和細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量；菌株培養(yǎng)基也會(huì)影響菌株凍干存活率，可用甘露糖替代原始培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)提高菌株存活率；此外還可通過可以采取冷刺激的方式改變菌株培養(yǎng)條件，使得菌株產(chǎn)生應(yīng)激蛋白提高其抗性。在噴霧干燥過程中，菌株關(guān)鍵酶活性、遺傳物質(zhì)的熱穩(wěn)定性及菌株抗氧化性均會(huì)對(duì)菌株噴霧干燥存活率產(chǎn)生影響，為了進(jìn)一步提升細(xì)菌的抗熱性，可通過調(diào)整噴霧干燥出口溫度，減少菌株熱損傷，還可以通過優(yōu)化細(xì)菌培養(yǎng)基碳氮源、對(duì)菌株進(jìn)行熱刺激使其產(chǎn)生熱應(yīng)激蛋白的方法，提高菌株干燥存活率。最后針對(duì)冷凍干燥和噴霧干燥兩種不同的干燥方式，在制備的工藝中添加相應(yīng)的冷凍、噴霧干燥保護(hù)劑，均有利于提高菌株活性及干燥存活率。