（武警工程大學(xué) 裝備管理與保障學(xué)院，西安 710086）

0 引 言

青海高原酸奶中含有多種天然抑菌物質(zhì)，具有維持腸道菌群平衡，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收等功能[1-6]。產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌來(lái)源非常廣泛[7-8]。本試驗(yàn)以我國(guó)部分地區(qū)高原自然發(fā)酵酸奶為試驗(yàn)材料，通過(guò)高效的定向篩選方法篩選乳酸菌素的產(chǎn)生菌株，對(duì)其發(fā)酵液生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，并對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行了個(gè)體形態(tài)、常規(guī)生理生化鑒定[9-12]及16SrDNA測(cè)序等系統(tǒng)的鑒定試驗(yàn)，以獲得抑菌活性高、遺傳特性穩(wěn)定的乳酸菌素產(chǎn)生菌，為實(shí)現(xiàn)食品防腐劑的廣譜、無(wú)毒化提供新的菌株資源。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

材料：高原自然發(fā)酵酸奶，采自青海牧區(qū)牧民家中。

菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、保加利亞乳桿菌、溶血鏈球菌、單增李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、番茄灰霉病菌、香蕉炭疽病、水稻紋枯病、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌、藤黃微球菌、酒精酵母、啤酒酵母、黑曲霉、黃曲霉菌，均由陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

試劑：酵母膏、牛肉膏、瓊脂、蛋白胨等，均為生物試劑；硫酸鎂、葡萄糖、磷酸氫二鉀等，均為分析純；MRS培養(yǎng)基、M 17瓊脂培養(yǎng)基、改良的M 17G培養(yǎng)基，按文獻(xiàn)[5，17]進(jìn)行配制。PCR反應(yīng)所需藥品、PCR引物、PCR基因測(cè)序等委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋，北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；生物潔凈工作臺(tái)，蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司；水浴恒溫振蕩器，太倉(cāng)市儀器設(shè)備廠；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，上海琪特分析儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)，上海分析儀器總廠；CENTRIFUGE 5804R離心機(jī)，EPPENDORF公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，江蘇國(guó)華電器有限公司；電泳儀，北京六一儀器廠；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀，加拿大BBI公司；電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；OLYMPUS BH 2顯微鏡，日本OLYMPUS公司；WET-SPM-9500J3原子力顯微鏡，日本島津公司；移液器，加拿大BBI公司；VITEK全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)，法國(guó)生物梅里埃公司；數(shù)碼相機(jī)，日本佳能公司；革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定卡試驗(yàn)(GPI)，法國(guó)生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的定向分離[9]

（1）乳酸鏈球菌素母液的配置。稱取100 mg乳酸鏈球菌素（原始效價(jià)為1 000 IU/mg），溶于20 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液中，此時(shí)效價(jià)為5 000 IU/mg，使用前需經(jīng)孔徑為0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌。

（2）菌株的分離。本研究51個(gè)菌株分離自青海高原自然發(fā)酵酸奶，分別取從不同采樣地采集的高原酸奶樣品，按1%接種量加入到含乳酸鏈球菌素和溴甲酚紫的M 17G液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h，把M 17G液體培養(yǎng)物制成10-4、10-5、10-6稀釋度的菌懸液，分別吸取0.1 mL放入M 17固體分離培養(yǎng)基上，涂布，28℃培養(yǎng)24 h，挑選單菌落，在分離培養(yǎng)基上劃線，反復(fù)3次。

（3）抑菌活性及抑菌譜測(cè)定。采用改進(jìn)濾紙片法[13-15]，該方法直觀，能準(zhǔn)確反映抑菌效果。將保藏的金黃色葡萄球菌或其他細(xì)菌轉(zhuǎn)接至活化培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)18 h，使菌體恢復(fù)生理活性。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)活化好的金黃色葡萄球菌菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水將菌液濃度調(diào)至106mL-1。將無(wú)菌濾紙片（d=6mm）放入乳酸菌發(fā)酵液中，浸泡30 min后取出濾紙片，貼于已涂布有濃度為106mL-1的金黃色葡萄球菌菌液的檢測(cè)平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在37℃下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小，取3次實(shí)驗(yàn)平均值。

1.3.2 菌株的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察。觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)[12]。

（2）原子力顯微鏡分子形貌觀察。將制備好的菌液用生理鹽水稀釋后涂于AFM專用載玻片上，自然干燥，采用日本島津公司的SPM 9500J3型原子力顯微鏡,室溫下大氣環(huán)境中對(duì)菌液的分子形態(tài)進(jìn)行掃描觀測(cè)。圖像均在Tapping模式下獲得，探針為Si3N4(微懸臂長(zhǎng)：200μm，彈性系數(shù)0.12 N/m)，原子力顯微鏡圖像的形態(tài)學(xué)特征(如高度、寬度等)均采用原子力顯微鏡附帶的軟件進(jìn)行分析。

（3）生理生化鑒定。主要采用檸橄酸鹽利用試實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅(M.R)實(shí)驗(yàn)、v-p實(shí)驗(yàn)、）明膠液化實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵、產(chǎn)氨試驗(yàn)及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定，具體方法參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）[16]。

（4）16Sr DNA序列分析[14-15]

1）DNA的提取。本研究使用上海生工生物技術(shù)公司提供的細(xì)菌基因組抽提試劑盒來(lái)提取DNA。

2）DNA檢測(cè)。用含有0.5μg/mL EB的0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，記錄結(jié)果。

3）16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增

①16SrDNA擴(kuò)增的引物。用于反應(yīng)的引物采用16SrDNA的PCR反應(yīng)的通用引物，引物的合成由上海生工生物技術(shù)公司完成。正向引物(P1)：5'-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物(P2)：5'-CTA CGGCTACCTTGTTACGA-3'。

②PCR反應(yīng)體系

③PCR擴(kuò)增條件。94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1.5 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共完成35個(gè)循環(huán)以后，72℃繼續(xù)延伸10 min，4℃保存。

④PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。用含有0.5μg/m L EB的0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，記錄結(jié)果。

⑤16S rDNA序列分析和同源性比較。將Z103菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到的測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST在Gen-Bank+EMBL+DDBJ基因庫(kù)中進(jìn)行同源性比較，從中得到菌株的序列信息。

（5）抑菌譜的測(cè)定。將供試菌種接種培養(yǎng)（細(xì)菌在37℃培養(yǎng)24 h，酵母菌和霉菌在28℃培養(yǎng)48～72 h）后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)活化好的菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水將菌液濃度調(diào)至106CFU/mL。用改進(jìn)濾紙片法測(cè)量抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

從青海高原酸奶中，采用定向分離乳鏈菌肽產(chǎn)生菌的方法：即在蔗糖作碳源和添加適當(dāng)乳鏈菌肽的改良M 17培養(yǎng)基上，以溴甲酚紫作指示劑，如一個(gè)菌株對(duì)乳鏈菌肽具有抗性，又能利用蔗糖，使菌落周?chē)囵B(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色，很容易用肉眼識(shí)別。然后檢測(cè)該菌株是否產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。分離到51株使培養(yǎng)基變黃的菌株，其中Z 103菌株的穩(wěn)定性、抑菌性好，因此選為實(shí)驗(yàn)菌株，如表1和表2所示。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將Z103菌株接種于改良的M 17G培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)1 d后觀察菌落。菌落呈乳白色，隆起，外形光滑，濕潤(rùn)，小白色顆粒沉淀，無(wú)菌膜、氣泡（圖1（a））。細(xì)菌革蘭氏染色陽(yáng)性，球狀，無(wú)莢膜和芽孢（圖1（b））

表1 初篩分離的菌株

表2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物效價(jià)測(cè)定

圖1 Z103菌株菌落圖和Z103革蘭氏染色

2.2.2 原子力顯微鏡觀察Z103菌株的分子形貌

由圖2可以看出，在20.00μm×20.00μm的觀測(cè)范圍內(nèi)Z103菌株的分子圖像清晰、穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)呈規(guī)則球形，形態(tài)飽滿，表面有很多突起。

2.2.3 菌株的生理生化特征

Z 103菌株常規(guī)生理生化鑒定結(jié)果如表3所示。

圖2 原子力顯微鏡觀察Z103菌株

表3 常規(guī)生理生化鑒定結(jié)果

綜合菌株培養(yǎng)特征、個(gè)體形狀及生理生化特性鑒定結(jié)果，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(1994）[16]、根據(jù)東秀珠主編《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（2001）[17]和凌代文、東秀珠主編《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》（1999）[18]，將Z103菌株初步鑒定為乳球菌屬（Lactococcus）中的乳酸乳球菌乳酸亞種（L.lactis subsp.Lactis）。

2.2.4 Z 103菌株的16SrDNA序列分析

（1）基因組DNA的提取結(jié)果?；蚪MDNA的提取結(jié)果如圖3所示。

圖3 基因組DNA的提取

（2）Z103菌株的16SrDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果。以菌株Z103的基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增16S rDNA片段，得到瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖4所示。

圖4 16Sr DNA PCR擴(kuò)增

（3）Z 103菌株的16SrDNA序列分析。Z103菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)出Z103菌株的16SrRNA基因序列總長(zhǎng)為1 329 bp，得到的測(cè)序結(jié)果如圖5所示。

（4）BLAST同源性搜索與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的繪制。將16S rDNA PCR擴(kuò)增測(cè)得的序列，在GenBank+EMBL+DDBJ基因庫(kù)進(jìn)行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)菌株Z103和Il1403、IL1403菌株的16S rDNA基因序列相似性達(dá)98.6%，在所有比較的菌株中相似性最高。而且，Z 103菌株的生理生化特征和Il1403、IL1403菌株的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征基本吻合，因此確定Z103菌株為乳酸乳球菌乳酸亞種的一種。

綜合同源性比對(duì)結(jié)果和Il1403、IL1403菌株在細(xì)菌發(fā)育系統(tǒng)中的位置，從GeneBank中選擇8個(gè)菌株的16Sr DNA基因序列，通過(guò)Bioedit7.0.1和MEGA4.0.2軟件進(jìn)行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖6。

圖5 菌株Z103的16SrRNA基因序列

圖6 基于16SrRNA基因序列的Z103菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2.5 Z 103菌株抑菌譜測(cè)定

Z 103菌株抑菌譜測(cè)定結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，Z 103菌株具有較廣的抑菌譜，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌作為檢測(cè)指示菌。從表4中還可以看出，它對(duì)食源性致病菌，如金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和溶血鏈球菌等具有很好的抑制作用；對(duì)食品腐敗菌，如藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌等抑制作用較好，顯示了在食品防腐作用中的應(yīng)用潛力。但對(duì)霉菌和酵母菌沒(méi)有作用。對(duì)很多植物的致病菌如香蕉炭疽病、番茄灰霉病菌、水稻紋枯病、油菜菌核病菌等有很好的抑制作用，說(shuō)明它在植物疾病的防治方面也有很好的作用。

表4 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜

3 結(jié) 論

本研究從青海高原酸奶中定向分離得到的乳酸菌經(jīng)形態(tài)學(xué)、原子力顯微鏡觀察、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，確定為乳酸乳球菌乳酸亞種。采用改進(jìn)濾紙片法研究Z103菌株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌作為檢測(cè)指示菌的抑菌性，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出，它不但對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效，而且對(duì)部分革蘭氏陰性菌都有較強(qiáng)抑制作用，顯示了它在食品保鮮防腐和植物疾病的防治方面的應(yīng)用潛力。也說(shuō)明其具有較廣譜的抗菌活性。