赫可偉，陳甲法，周子鍵，吳建宇,

基于宿主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)創(chuàng)制抗擬輪枝鐮孢玉米自交系

赫可偉1，陳甲法2，周子鍵2，吳建宇

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450002；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002

【】擬輪枝鐮孢（）是一種主要的病原真菌，侵染玉米可以導(dǎo)致穗粒腐病、莖腐病、苗期根腐病及引起種子腐爛。由擬輪枝鐮孢引起的病害不僅影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且其病原菌代謝過程中產(chǎn)生的伏馬菌素等多種真菌毒素嚴(yán)重威脅了人畜安全。通過宿主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技術(shù)創(chuàng)制抗擬輪枝鐮孢的玉米種質(zhì)，為玉米抗病育種提供新的優(yōu)異抗源。通過同源克隆方法克隆可能與擬輪枝鐮孢生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因，并通過體外轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的dsRNA片段；將不同基因的dsRNA與擬輪枝鐮孢的分生孢子懸浮液預(yù)混后，用于后續(xù)的體外RNA沉默試驗(yàn)；對(duì)感病玉米自交系西502的種子進(jìn)行消毒與接種，在培養(yǎng)皿中28℃避光培養(yǎng)48 h，調(diào)查種子的發(fā)病程度；在混有dsRNA的孢子懸浮液中加入葡萄糖，25℃培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)與菌絲生長(zhǎng)情況；將三葉期的西502幼苗轉(zhuǎn)移至預(yù)混dsRNA的孢子懸浮液中進(jìn)行培養(yǎng)，7 d后觀察苗期根腐病發(fā)病狀況；通過種子鑒定與苗期鑒定體系，逐步篩選具有顯著抑制效果的沉默靶標(biāo)基因；合成篩選出的重點(diǎn)靶標(biāo)基因片段，構(gòu)建沉默載體并轉(zhuǎn)化感病玉米自交系西502；對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的種子接種鑒定，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化玉米株系的抗性；提取接種后轉(zhuǎn)基因種子的總RNA，對(duì)擬輪枝鐮孢的靶標(biāo)基因進(jìn)行熒光定量分析，確定HIGS株系的沉默效果。從擬輪枝鐮孢中克隆出18個(gè)與其生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的候選基因；通過種子接種鑒定，發(fā)現(xiàn)11個(gè)候選基因被沉默后，種子的發(fā)病等級(jí)極顯著降低；進(jìn)一步篩選出6個(gè)沉默后影響擬輪枝鐮孢的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的候選靶標(biāo)基因、、、、和；通過苗期接種鑒定，最后篩選出3個(gè)在體外具有顯著抑制效果的沉默靶標(biāo)基因、和；進(jìn)而將3個(gè)靶標(biāo)基因的特異區(qū)段人工融合成一段序列并構(gòu)建沉默載體，獲得轉(zhuǎn)基因植株；鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的T2代種子對(duì)擬輪枝鐮孢的抗性顯著增強(qiáng)，且3個(gè)靶標(biāo)基因的表達(dá)量均顯著下降。擬輪枝鐮孢基因、、與其生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，且沉默后能夠顯著提升玉米對(duì)擬輪枝鐮孢的抗性。

玉米；擬輪枝鐮孢；宿主誘導(dǎo)基因沉默；轉(zhuǎn)基因；穗粒腐病

0 引言

【研究意義】由于擬輪枝鐮孢引起的玉米病害（如穗粒腐病、莖腐病、苗期根腐病以及種子腐爛等）多數(shù)是通過空氣與土壤傳播，因而缺乏有效的防治措施[1]。擬輪枝鐮孢引起的玉米穗粒腐病不僅直接影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且其病原菌代謝過程中產(chǎn)生的伏馬菌素等多種真菌毒素嚴(yán)重威脅人畜安全[2-3]。越來越多的證據(jù)表明，由擬輪枝鐮孢屬產(chǎn)生的真菌毒素如伏馬菌素，可引起馬腦白質(zhì)軟化癥和豬肺水腫等牲畜疾病[4-5]，且與中國(guó)部分地區(qū)高發(fā)的食道癌有關(guān)[6-8]。近年來，隨著對(duì)食品安全問題的普遍關(guān)注，玉米穗粒腐病和種子腐爛等問題成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。防治真菌病害的一個(gè)有效手段是克隆主效抗病基因并用于育種改良，ZUO等[9]和WANG等[10]在玉米絲黑穗病、莖腐病等遺傳改良中取得了突破性進(jìn)展，并為抗病育種樹立了成功的典范。然而作為微效多基因控制的、由擬輪枝鐮孢引起的玉米穗粒腐等病害，圖位克隆并聚合抗病基因需要一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間和過程。因此，通過新的手段創(chuàng)制抗病種質(zhì)并選育抗擬輪枝鐮孢的玉米新品種，對(duì)國(guó)家的糧食生產(chǎn)安全具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】有關(guān)玉米對(duì)擬輪枝鐮孢的抗性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者比較系統(tǒng)地研究了玉米穗粒腐病和苗期根腐病抗性。經(jīng)典數(shù)量遺傳學(xué)研究認(rèn)為玉米穗粒腐病抗性是由微效多基因控制的數(shù)量性狀，且以加性效應(yīng)為主[11]。結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)，PéREZ-BRITO等[12]首次報(bào)道了由擬輪枝鐮孢引起的玉米穗粒腐病抗性遺傳研究成果，利用墨西哥育種材料組配的2個(gè)F2:3群體，分別鑒定出9個(gè)和7個(gè)QTL，其中3個(gè)是在2個(gè)群體中共同檢測(cè)到的一致性QTL。北卡羅萊那大學(xué)玉米抗病課題組基于美國(guó)種質(zhì)資源抗性鑒定的基礎(chǔ)上，利用抗病自交系GE440與感病自交系FR1064構(gòu)建的BC1F1:2群體及抗病自交系NC300與感病自交系B104構(gòu)建的重組自交系（recombinant inbred line，RIL）群體，分別鑒定出7個(gè)和5個(gè)抗穗粒腐病QTL，單個(gè)QTL解釋了4.4%—5.8%的表型貢獻(xiàn)率[13]；而意大利的Maschietto等[14]以毒素為鑒定指標(biāo)，鑒定出一些與穗粒腐病抗性相關(guān)的QTL。Septiani等[15]利用401份多親本高世代互交系（multiparent advanced generation inter-cross，MAGIC）群體，鑒定出10個(gè)苗期根腐抗病QTL，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，預(yù)測(cè)了候選基因。張帆等[16]在四川省雅安市和綿陽市兩地對(duì)抗病自交系R15和感病自交系掖478組配的F2群體進(jìn)行抗性鑒定，在第1、2、3、4、6、7和9染色體上檢測(cè)出10個(gè)抗穗粒腐病QTL，其中第6染色體上的QTL是環(huán)境一致性QTL。Ding等[17]利用抗病自交系87-1和感病自交系綜3衍生的重組自交系群體，檢測(cè)到6個(gè)抗穗粒腐病QTL，其中在第35染色體上分別檢測(cè)到2個(gè)QTL，在第8和10染色體上分別檢測(cè)到1個(gè)QTL，第3染色體上的和2個(gè)QTL是多環(huán)境穩(wěn)定的QTL。近年來，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，全基因組關(guān)聯(lián)分析成為了鑒定作物抗病基因的重要手段。Stagnati等[18]利用230份自交系構(gòu)建了關(guān)聯(lián)群體并篩選出226 446個(gè)SNP標(biāo)記，鑒定出164個(gè)與苗期根腐病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)及25個(gè)相關(guān)的抗病候選基因。Zila等[19]利用1 687份美國(guó)玉米自交系建立的關(guān)聯(lián)群體及200 978個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行分析，鑒定出7個(gè)與抗性顯著相關(guān)的SNP及6個(gè)抗病候選基因。Lanubile等[20]對(duì)抗病自交系CO441與感病自交系CO354接種擬輪枝鐮孢后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)茉莉酸和乙烯合成途徑與抗性相關(guān)，并誘導(dǎo)了多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。YAO等[21]利用關(guān)聯(lián)分析法鑒定出34個(gè)與穗粒腐抗性緊密關(guān)聯(lián)的SNP及69個(gè)抗穗粒腐病候選基因，其中包括一些植物激素相關(guān)基因及傳統(tǒng)抗病蛋白。宿主誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)是指通過宿主植物生成的RNA誘導(dǎo)病原體基因沉默的方法，是一種基于RNA干涉原理進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新的基因工程技術(shù)。它根據(jù)病原菌生長(zhǎng)或致病相關(guān)基因的特異性序列，設(shè)計(jì)RNAi載體，利用轉(zhuǎn)基因宿主植物生成針對(duì)目標(biāo)病原菌的效應(yīng)RNA，從而通過跨物種的沉默抑制病原菌的生長(zhǎng)達(dá)到抗病效果。HIGS技術(shù)最早應(yīng)用在病毒病害的防治上[22-23]，1995年在夏威夷證實(shí)了HIGS轉(zhuǎn)基因番木瓜“UH-Rainbow”高抗環(huán)斑病毒。BAUM等[24]研究表明轉(zhuǎn)V-ATPase A dsRNA的玉米植株可以顯著降低玉米根蟲病害的危害。這些試驗(yàn)證實(shí)了HIGS技術(shù)是一種目的性強(qiáng)、效率高的抗病種質(zhì)創(chuàng)新手段。2007年，Khatri等[25]利用RNAi研究構(gòu)巢曲霉多胺途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)巢曲霉孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)時(shí)可以直接從培養(yǎng)基中攝取RNA導(dǎo)致自身沉默，這表明在非人工刺激條件下真菌也可以從生長(zhǎng)環(huán)境中攝入外源siRNA導(dǎo)致自身沉默。2010年，TinOco等[26]將轉(zhuǎn)入擬輪枝鐮孢中，并將表達(dá)沉默的RNA序列載體轉(zhuǎn)入煙草中，用轉(zhuǎn)基因擬輪枝鐮孢接種正常與轉(zhuǎn)基因煙草葉片，發(fā)現(xiàn)只能在正常煙草葉片上檢測(cè)到發(fā)出熒光的菌斑，證實(shí)了通過宿主植物表達(dá)的dsRNA可以沉默寄生病原菌的基因表達(dá)，也預(yù)示HIGS可能為抗真菌種質(zhì)改良提供一種新的育種方案。實(shí)踐上，Nowara等[27]在2010年通過沉默白粉病致病基因，獲得抗白粉病的轉(zhuǎn)基因小麥，證實(shí)了可以通過宿主誘導(dǎo)RNA干涉的方法使植物獲得病原真菌的抗性。Koch等[28]通過體外RNA沉默試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)根據(jù)禾谷鐮孢設(shè)計(jì)的一段791堿基的dsRNA序列可以抑制其生長(zhǎng)發(fā)育，并以此為靶標(biāo)獲得了高抗禾谷鐮孢的大麥轉(zhuǎn)基因植株，該研究提出并驗(yàn)證了體外篩選病原真菌發(fā)育關(guān)鍵基因作為靶標(biāo)創(chuàng)制HIGS株系的方案。2017年，THAKARE等[29]利用HIGS技術(shù)，成功將黃曲霉毒素合成過程關(guān)鍵基因中的3個(gè)片段人工合成在一起構(gòu)建沉默載體并轉(zhuǎn)入玉米中，第一次成功獲得了抑制黃曲霉毒素的玉米植株，在玉米上證實(shí)了HIGS技術(shù)防治真菌病害的可行性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】圍繞玉米擬輪枝鐮孢抗性已經(jīng)鑒定出一些抗性QTL及候選基因，但多數(shù)鑒定的QTL效應(yīng)較小，進(jìn)行候選基因的圖位克隆與功能研究以實(shí)現(xiàn)抗病多基因的聚合需要一個(gè)較長(zhǎng)的過程，宿主誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)（host-induced gene silence，HIGS）提供了創(chuàng)制抗病種質(zhì)的另一種解決方案?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過篩選擬輪枝鐮孢生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因作為靶標(biāo)，利用HIGS技術(shù)創(chuàng)制抗擬輪枝鐮孢的新種質(zhì)，為玉米抗病育種提供新的元件，并為創(chuàng)制優(yōu)異抗源提供新方案。

1 材料與方法

1.1 擬輪枝鐮孢生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的克隆

根據(jù)已報(bào)道數(shù)據(jù)，查找與作物致病真菌生長(zhǎng)發(fā)育或致病性相關(guān)的關(guān)鍵基因，運(yùn)用BLAST比對(duì)，確定在擬輪枝鐮孢基因組中的同源基因共18個(gè)（表1），并克隆與擬輪枝鐮孢發(fā)育相關(guān)的基因序列，作為HIGS沉默抗擬輪枝鐮孢的候選靶標(biāo)基因。

1.2 dsRNA的體外合成

與玉米基因組比對(duì)后，選擇候選靶標(biāo)基因內(nèi)無連續(xù)超過20個(gè)堿基匹配的特異序列片段設(shè)計(jì)引物，并在序列兩端分別加上T7轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄識(shí)別序列（電子附表1）。通過PCR擴(kuò)增，獲得兩端帶有T7啟動(dòng)子的體外轉(zhuǎn)錄模板。使用HiScribe? T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit（NEB）試劑盒，對(duì)模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得候選靶標(biāo)基因的dsRNA。

1.3 擬輪枝鐮孢孢子懸浮液的制備

從自然發(fā)病的玉米籽粒上分離擬輪枝鐮孢（），經(jīng)單菌落分離純化，經(jīng)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，4℃保存?zhèn)溆?。接種前將分離純化的擬輪枝鐮孢26℃活化。然后接種到PD培養(yǎng)基，200 r/min培養(yǎng)24 h。收集孢子懸浮液，并用無菌水稀釋至1×106個(gè)/mL。參考Koch等[28]的體外沉默試驗(yàn)方法，在孢子液中分別加入候選靶標(biāo)基因的dsRNA至終濃度10 ng·μL-1，用于后續(xù)的體外接種試驗(yàn)。

1.4 基于種子抗性鑒定的候選靶標(biāo)基因篩選

西502玉米自交系是河南農(nóng)業(yè)大學(xué)吳建宇課題組鑒定出的多組織多性狀高感擬輪枝鐮孢的塘四平頭血緣自交系[43-44]。挑選整齊一致的西502種子，用75%的酒精表面消毒30 s，然后用3%次氯酸鈉消毒15 min，無菌水沖洗3—4次后，將種子接入準(zhǔn)備好的孢子液中，以接種水為空白對(duì)照，加入的dsRNA為陰性對(duì)照。接菌后將種子放在鋪入濕濾紙的培養(yǎng)皿中，28℃避光培養(yǎng)。由于早期癥狀不明顯，而后期RNA會(huì)在環(huán)境中降解，通過預(yù)試驗(yàn)確定，48 h后調(diào)查20粒種子的發(fā)病情況。單粒種子的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為1：無明顯菌絲；3：菌絲覆蓋面積＜25%；5：25%≤菌絲覆蓋面積＜50%；7：50%≤菌絲覆蓋面積＜75%；9：菌絲覆蓋面積≥75%。

1.5 基于病原菌發(fā)育形態(tài)觀察的候選靶標(biāo)基因驗(yàn)證

將200 μL混有dsRNA的孢子液移入2.0 mL離心管中，并加入終濃度1%的葡萄糖。25℃培養(yǎng)24 h后，分別取樣在顯微鏡下觀察，檢測(cè)沉默候選靶標(biāo)基因?qū)M輪枝鐮孢萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的抑制效果。

1.6 基于苗期抗性鑒定的靶標(biāo)基因篩選

參考大田用的孢子懸浮液灌根接種法[45]，挑選三葉期的西502幼苗，用純凈水將其根部清洗干凈，轉(zhuǎn)移至裝有不同dsRNA的30 mL孢子液的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)3株。7 d后觀察幼苗的苗期根腐病發(fā)病狀況，進(jìn)一步篩選高效的沉默靶標(biāo)基因。根據(jù)葉片枯黃狀況劃分發(fā)病等級(jí)：1級(jí)：沒有枯黃面積超過一半的葉片；3級(jí)：僅有一片葉片枯黃面積超過一半；5級(jí)：2個(gè)葉片的枯黃面積超過一半；7級(jí)：3個(gè)葉片的枯黃面積超過一半但植株未死亡；9級(jí)：植株完全枯死。

1.7 HIGS轉(zhuǎn)基因株系的構(gòu)建和鑒定

在篩選出的關(guān)鍵靶標(biāo)基因上分別篩選200 bp左右的特異沉默序列，參考抗黃曲霉毒素HIGS株系創(chuàng)制的策略[29]，將這些序列融合成一條連續(xù)的序列，合并的序列在金維智公司合成并連接到pFGC5941沉默載體上，然后轉(zhuǎn)化感病玉米自交系西502，兩代篩選后獲得陽性株的T2代種子。參考JU等[46]的方法對(duì)篩選的野生型西502和HIGS轉(zhuǎn)基因株系的種子進(jìn)行接種鑒定，提取接種后3 d的野生型與轉(zhuǎn)基因株系種子的RNA，通過qRT-PCR檢測(cè)靶基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 擬輪枝鐮孢沉默靶標(biāo)基因的初步篩選

由于擬輪枝鐮孢與玉米互作的致病基因報(bào)道較少，參考體外篩選病原真菌發(fā)育關(guān)鍵基因確定標(biāo)基因進(jìn)而創(chuàng)制抗白粉病小麥種質(zhì)的方案[28]，從擬輪枝鐮孢中克隆出18個(gè)已報(bào)道與病原真菌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因（表1）。針對(duì)這18個(gè)沉默候選靶標(biāo)基因，選擇與玉米基因組相似度較低的沉默片段進(jìn)行擴(kuò)增，并在兩端加上T7轉(zhuǎn)錄酶的啟動(dòng)序列。以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄獲得針對(duì)18個(gè)候選靶標(biāo)基因的dsRNA（圖1）。

為了篩選有效的沉默靶標(biāo)基因，將擬輪枝鐮孢的孢子液與不同候選靶標(biāo)基因的沉默片段dsRNA混合后，對(duì)感病玉米自交系西502的種子進(jìn)行接種鑒定。未加入dsRNA的空白對(duì)照組平均發(fā)病等級(jí)為6.3，沉默的陰性對(duì)照組平均發(fā)病等級(jí)為5.9，且與空白對(duì)照無顯著差異。在加入不同dsRNA的18個(gè)處理組中，種子的平均發(fā)病等級(jí)為2.3—5.3，與對(duì)照相比，有5組種子受擬輪枝鐮孢的侵染程度顯著降低，11組極顯著降低（圖2）。其中，沉默的處理組種子發(fā)病程度最低，平均發(fā)病等級(jí)為2.3，降低至對(duì)照的37%。選擇效應(yīng)極顯著的11個(gè)對(duì)照組的候選靶標(biāo)基因作為初步篩選的靶標(biāo)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 候選沉默靶標(biāo)基因的體外驗(yàn)證

利用1%葡萄糖溶液對(duì)擬輪枝鐮孢孢子進(jìn)行培養(yǎng)，并分別加入初篩出的11個(gè)靶標(biāo)基因?qū)?yīng)的dsRNA，觀察孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)24 h后，未加入dsRNA的對(duì)照組中擬輪枝鐮孢孢子大部分萌發(fā)且菌絲生長(zhǎng)良好，而11個(gè)處理組中有6組擬輪枝鐮孢孢子的萌發(fā)率和菌絲生長(zhǎng)速度明顯受到抑制（圖3）。初步確認(rèn)、、、、和可能是參與擬輪枝鐮孢的孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因，選擇它們進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.3 高效沉默靶標(biāo)基因的最終確定

分別用篩選出的6個(gè)候選靶標(biāo)基因及陰性對(duì)照的dsRNA與擬輪枝鐮孢孢子液混合，并處理玉米幼苗，培養(yǎng)7 d后觀察幼苗生長(zhǎng)狀況。未加入dsRNA的空白對(duì)照組和加入dsRNA的陰性對(duì)照組中幼苗發(fā)病最重，葉片枯死、根部腐爛且植株生長(zhǎng)矮小，平均發(fā)病等級(jí)均為6.33；其他處理組發(fā)病狀況由重至輕分別為、、、、和的沉默組。其中、和的沉默組中幼苗的長(zhǎng)勢(shì)良好，發(fā)病等級(jí)分別為3.67、3.33和2.67，發(fā)病程度較對(duì)照顯著降低（圖4）。因此，將、和確定為HIGS技術(shù)沉默擬輪枝鐮孢的最終靶標(biāo)基因。

*：P＜0.05，**：P＜0.01。下同The same as below

2.4 抗擬輪枝鐮孢玉米轉(zhuǎn)基因株系的構(gòu)建及驗(yàn)證

分別從、和內(nèi)選擇200、222和200 bp的沉默區(qū)段，合并為622 bp長(zhǎng)度的人工合成序列（圖5）。將該序列連接至沉默載體pFGC5941，并轉(zhuǎn)化感病玉米自交系西502，獲得2個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因T0植株，經(jīng)篩選兩代后獲得T2代轉(zhuǎn)基因種子。

對(duì)野生型和2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的種子進(jìn)行接種鑒定。在接種擬輪枝鐮孢7 d后，野生型種子平均發(fā)病等級(jí)為4.9，而2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分別為3.4和2.8，均極顯著低于野生型（圖6）。對(duì)靶標(biāo)基因的定量分析結(jié)果顯示，3個(gè)靶基因在2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量為野生型的38.1%—76.3%，均顯著低于野生型，達(dá)到了宿主誘導(dǎo)的基因沉默效果。研究表明，HIGS轉(zhuǎn)基因株系可以通過抑制擬輪枝鐮孢關(guān)鍵基因的表達(dá)從而顯著提高玉米對(duì)輪枝鐮孢的抗性。

3 討論

3.1 基于宿主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)創(chuàng)制抗擬輪枝鐮孢玉米種質(zhì)的策略選擇

玉米對(duì)擬輪枝鐮孢的抗性是多基因控制的數(shù)量性狀，目前，鑒定出的抗性QTL及候選基因抗病效應(yīng)較小，通過圖位克隆獲得抗病基因并進(jìn)行功能解析從而開發(fā)功能標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新或抗病基因聚合存在一定難度。以病原菌關(guān)鍵致病基因或生長(zhǎng)發(fā)育基因?yàn)榘袠?biāo)并通過宿主誘導(dǎo)基因沉默的方法創(chuàng)制抗病新種質(zhì)是另一種值得探索的防治方案。HIGS的方法最早用于防治病毒和昆蟲，但近年來也多有成功應(yīng)用到真菌防治的報(bào)道。在此基礎(chǔ)上，研究嘗試通過HIGS技術(shù)獲得了抗擬輪枝鐮孢的玉米轉(zhuǎn)基因株系，為玉米擬輪枝鐮孢病害的抗性種質(zhì)創(chuàng)制提供了新的方案。

A：接種7 d后的玉米幼苗外觀。B：接種7 d后玉米苗期根腐病發(fā)病等級(jí)的統(tǒng)計(jì)

圖5 人工合成的靶標(biāo)序列

A：接種后7 d后野生型和HIGS株系種子的外觀。B：接種7 d后野生型和HIGS株系種子的發(fā)病等級(jí)統(tǒng)計(jì)。C：接種3 d后3個(gè)靶標(biāo)基因在野生型和HIGS株系中的相對(duì)表達(dá)量

HIGS所選用的沉默靶標(biāo)基因通常為功能明確的病原基因。一般分為兩類：一類是直接影響病原真菌致病或產(chǎn)毒能力的基因[27,29]；另一類則是病原真菌自身生長(zhǎng)發(fā)育所必需的基因[28]。在玉米抗黃曲霉毒素HIGS株系創(chuàng)制的研究中，沒有檢測(cè)到HIGS轉(zhuǎn)基因株系的果穗內(nèi)有黃曲霉毒素，但黃曲霉菌的數(shù)量并沒有顯著減少[29]，也就是說抑制毒素合成基因雖然可以降低真菌毒素對(duì)人畜的危害，但可能無法降低病原菌對(duì)玉米產(chǎn)量造成的損失。由于玉米抗病基因與擬輪枝鐮孢致病基因及其互作的研究均較少，因此，選擇致病基因最為靶標(biāo)基因較為困難?；谝陨显?，試驗(yàn)選用了病原菌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因作為候選的沉默靶標(biāo)。

3.2 關(guān)鍵沉默靶標(biāo)基因的篩選方法

由于難以預(yù)測(cè)眾多靶標(biāo)基因沉默后的表型以及考慮到轉(zhuǎn)基因在時(shí)間與經(jīng)濟(jì)上的高昂成本，因此，在創(chuàng)制HIGS轉(zhuǎn)基因株系之前需要對(duì)候選靶標(biāo)基因進(jìn)行初篩。例如，在小麥的研究中，有時(shí)會(huì)利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行初步的篩選與驗(yàn)證[26]。然而，由于玉米具有豐富的遺傳多樣性，尚無穩(wěn)定成熟的瞬時(shí)沉默體系可用。Khatri等[25]發(fā)現(xiàn)在構(gòu)巢曲霉孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)時(shí)直接從培養(yǎng)基中攝取siRNA導(dǎo)致了自身沉默現(xiàn)象；而Koch等[28]通過dsRNA的體外沉默試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮孢可以被體外的dsRNA沉默從而抑制其生長(zhǎng)。這些研究證實(shí)了一些真菌可以吸收環(huán)境中的RNA并導(dǎo)致自身基因的沉默，為關(guān)鍵靶標(biāo)基因的體外篩選帶來了便利。通過體外合成dsRNA并進(jìn)行沉默試驗(yàn)，相繼從18個(gè)真菌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因中篩選出3個(gè)高效沉默靶標(biāo)，并進(jìn)一步成功創(chuàng)制了HIGS抗病株系。在此過程中，dsRNA在體外對(duì)擬輪枝鐮孢的沉默效應(yīng)通過形態(tài)學(xué)和致病性觀察等得到驗(yàn)證，這與Koch等[28]的研究結(jié)果吻合。體外dsRNA沉默試驗(yàn)篩選靶標(biāo)基因的初步探索，為后續(xù)的HIGS靶標(biāo)確定提供了一個(gè)便捷的方法。然而，該方法是否適用于其他真菌，以及對(duì)dsRNA的長(zhǎng)度與濃度有何要求和限制，尚需進(jìn)一步試驗(yàn)。

3.3 通過同時(shí)沉默deo、Atg15和Frp1獲得抗擬輪枝鐮孢的玉米種質(zhì)

本研究最終篩選到3個(gè)高效沉默靶標(biāo)基因、和。其中編碼一個(gè)脫氧輔蛋白合成酶，該基因被抑制后，禾谷鐮孢生長(zhǎng)減緩，而小麥及玉米對(duì)它的抗性顯著提高[42]。編碼一個(gè)與自我吞噬相關(guān)的脂肪酶，它被證實(shí)影響禾谷鐮孢的菌絲生長(zhǎng)[37]。在尖孢鐮刀菌中編碼一個(gè)與致病性相關(guān)的F-box蛋白，發(fā)現(xiàn)它與擬輪枝鐮孢的生長(zhǎng)可能相關(guān)[39]。由于這3個(gè)基因在體外沉默試驗(yàn)中均有較好的抑菌效果，因此，本研究探索了同時(shí)沉默這3個(gè)靶標(biāo)基因的設(shè)計(jì)。RNA干擾的機(jī)制是匹配后的dsRNA在體內(nèi)dicer酶或其同工酶的作用下切割成18 bp左右的小片段，進(jìn)而沉默目標(biāo)基因并產(chǎn)生二次擴(kuò)散。因此，沉默載體中不需要表達(dá)完整的蛋白編碼序列，僅需要表達(dá)目標(biāo)基因的部分序列，轉(zhuǎn)錄出的RNA被切割成不同siRNA后共同沉默目標(biāo)基因。以往研究發(fā)現(xiàn)，在同一個(gè)表達(dá)框中表達(dá)基因不同片段的人工合成序列，可以提高目標(biāo)基因的沉默效率[29]。在此啟發(fā)下，試驗(yàn)將3個(gè)靶標(biāo)基因的部分序列人工合成在一段序列之中并構(gòu)建沉默載體，成功創(chuàng)制了HIGS抗病株系，并同時(shí)檢測(cè)到HIGS株系對(duì)這3個(gè)擬輪枝鐮孢基因的沉默效果，為今后多基因沉默的轉(zhuǎn)基因株系設(shè)計(jì)提供了方案。

4 結(jié)論

擬輪枝鐮孢基因、和對(duì)擬輪枝鐮孢的孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，其轉(zhuǎn)基因HIGS植株對(duì)玉米苗期根腐病、莖腐病、穗粒腐病有一定的抗性。

[1] 王曉鳴, 晉齊鳴, 石潔, 王作英, 李曉. 玉米病害發(fā)生現(xiàn)狀與推廣品種抗性對(duì)未來病害發(fā)展的影響. 植物病理學(xué)報(bào), 2006, 36(1): 1-11.

WANG X M, JIN Q M, SHI J, WANG Z Y, LI X. The status of maize diseases and the possible effect of variety resistance on disease occurrence in the future. Acta Phytopathologica Sinica, 2006, 36(1): 1-11. (in Chinese)

[2] KAMLE M, MAHATO D K, DEVI S, LEE K E, KANG S G, KUMAR P. Fumonisins: Impact on agriculture, food, and human health and their management strategies. Toxins, 2019, 11(6): 328.

[3] Knutsen H K, Alexander J, Barreg?rd L, Bignami M, Brüschweiler B, Ceccatelli S, Cottrill B, Dinovi M, Edler L, Grasl-Kraupp B, Hogstrand C, Hoogenboom L, Nebbia C S, Petersen A, Rose M, Roudot A C, Schwerdtle T, Vleminckx C, Vollmer G, Wallace H, Dall'Asta C, Eriksen G S, Taranu I, Altieri A, Roldán- Torres R, Oswald I P. Risks for animal health related to the presence of fumonisins, their modified forms and hidden forms in feed. EFSA Journal, 2018, 16(5): 5242.

[4] ROSS P F, RICE L G, PLATTNER R D, OSWEILER G D, WILSON T M, OWENS D L, NELSON H A, RICHARD J L. Concentrations of fumonisin B1 in feeds associated with animal health problems. Mycopathologia, 1991, 114(3): 129-135.

[5] MARASAS W F O. Fumonisins: Their implications for human and animal health. Natural Toxins, 1995, 3(4): 193-198.

[6] GELDERBLOM W C A, JASKIEWICZ K, MARASAS W F O, THIEL P G, HORAK R M, VLEGGAAR R, KRIEK N P. Fumonisins: novel mycotoxins with cancer-promoting activity produced by. Applied & Environmental Microbiology, 1988, 54(7): 1806-1811.

[7] YOSHIZAWA T, YAMASHITA A, LUO Y. Fumonisin occurrence in corn form high-risk and low-risk areas for human esophageal cancer in china. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60(5): 1626-1629.

[8] Ueno Y, Iijima K, Wang S D, Sugiura Y, Sekijima M, Tanaka T, Chen C, Yu S Z. Fumonisins as a possible contributory risk factor for primary liver cancer: A 3-year study of corn harvested in Haimen, China, by HPLC and ELISA. Food and Chemical Toxicology, 1997, 35(12): 1143-1150.

[9] ZUO W, CHAO Q, ZHANG N, YE J, TAN G, LI B, XING Y, ZHANG B, LIU H, FENGLER K A, ZHAO J, ZHAO X, CHEN Y, LAI J, YAN J, XU M. A maize wall-associated kinase confers quantitative resistance to head smut. Nature genetics, 2015, 47(2): 151-157.

[10] WANG C, YANG Q, WANG W, LI Y, GUO Y, ZHANG D, MA X, SONG W, ZHAO J, XU M. A transposon-directed epigenetic change inunderlies quantitative resistance to Gibberella stalk rot in maize. The New phytologist, 2017, 215(4): 1503-1515.

[11] LUNSFORD J N, FUTRELL M C, SCOTT G E. Maternal influence on response of corn to. Phytopathology, 1974, 65: 223-225.

[12] PéREZ-BRITO S, JEFFERS D, GONZàLEZ-DE-LEóN D, KHAIRALLAH M, CORTéS-CRUZ M, VELàZQUEZ-CARDELAS G, AZPIROZ-RIVERO S, SRINIVASAN G. QTL mapping ofear rot resistance in highland maize, México. Agrociencia, 2001, 35: 181-196.

[13] ROBERTSON-HOYT L A, JINES M P, BALINT-KURTI P J, KLEINSCHMIDT C E, WHITE D G, PAYNE G A, MARAGOS C M, MOLNáR T L, HOLLAND J B. QTL mapping for Fusarium ear rot and fumonisin contamination resistance in two maize populations. Crop Science, 2006, 46(4): 1734-1745.

[14] MASCHIETTO V, COLOMBI C, PIRONA R, PEA G, STROZZI F, MAROCCO A, ROSSINI L, LANUBILE A. QTL mapping and candidate genes for resistance to Fusarium ear rot and fumonisin contamination in maize. BMC Plant Biology, 2017, 17(1): 20.

[15] SEPTIANI P, LANUBILE A, STAGNATI L, BUSCONI M, NELISSEN H, MARIO ENRICO P, DELL’ACQUA M, MAROCCO A. Unravelling the genetic basis of Fusarium seedling rot resistance in the MAGIC maize population: novel targets for breeding. Scientific reports, 2019, 9(1): 5665.

[16] 張帆, 萬雪琴, 潘光堂. 玉米抗穗粒腐病QTL定位. 作物學(xué)報(bào), 2007, 33(3): 491-496.

ZHANG F, WAN X Q, PAN G T. Molecular mapping of QTL for resistance to maize ear rot caused by. Acta Agronomica Sinica, 2007, 33(3): 491-496. (in Chinese)

[17] DING J Q, WANG X M, CHANDER S, YAN J B, LI J S. QTL mapping of resistance to Fusarium ear rot using a RIL population in maize. Molecular Breeding, 2008, 22(3): 395-403.

[18] STAGNATI L, LANUBILE A, SAMAYOA L F, BRAGALANTI M, GIORNI P, BUSCONI M, HOLLAND J B, MAROCCO A. A genome wide association study reveals markers and genes associated with resistance toinfection of seedlings in a maize diversity panel. Genes, Genomes, Genetics, 2019, 9(2): 571-579.

[19] ZILA C T, OGUT F, ROMAY M C, GARDNER C A, BUCKLER E S, HOLLAND J B. Genome-wide association study of Fusarium ear rot disease in the U.S.A. maize inbred line collection. BMC Plant Biology, 2014, 14: 372.

[20] LANUBILE A, FERRARINI A, MASCHIETTO V, DELLEDONNE M, MAROCCO A, BELLIN D. Functional genomic analysis of constitutive and inducible defense responses toinfection in maize genotypes with contrasting ear rot resistance. BMC Genomics, 2014, 15(1): 710.

[21] YAO L, LI Y, MA C, TONG L, DU F, XU M. Combined genome-wide association study and transcriptome analysis reveal candidate genes for resistance to Fusarium ear rot in maize.Journal of Integrative Plant Biology, 2020, 62(10): 1535-1551.

[22] SUDARSHANA M R, ROY G, FALK B W. Methods for engineering resistance to plant viruses. Methods in Molecular Biology, 2007, 354: 183-195.

[23] WATERHOUSE P M, FUSARO A F. Viruses face a double defense by plant small RNAs. Science, 2006, 313(5783): 54-55.

[24] BAUM J A, BOGAERT T, CLINTON W, HECK G R, FELDMANN P, ILAGAN O, JOHNSON S, PLAETINCK G, MUNYIKWA T, PLEAU M, VAUGHN T, ROBERTS J. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology, 2007, 25(11): 1322-1326.

[25] Khatri M, Rajam M V. Targeting polyamines ofsiRNA specific to fungal ornithine decarboxylase gene. Medical Mycology, 2007, 45(3): 211-220.

[26] TINOCO M, BáRBARA D, DALL'ASTTA R, JO?O P, ARAG?O F.trans-specific gene silencing in fungal cells by in planta expression of a double-stranded RNA. BMC Biology, 2010, 8: 27.

[27] NOWARA D, GAY A, LACOMME C, SHAW J, RIDOUT C, DOUCHKOV D, HENSEL G, KUMLEHN J, SCHWEIZER P. HIGS: Host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen. The Plant Cell, 2010, 22(9): 3130-3141.

[28] KOCH A, KUMAR N, WEBER L, KELLER H, IMANI J, KOGEL K H. Host-induced gene silencing of cytochrome P450 lanosterol C14 -demethylase-encoding genes confers strong resistance to. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2013, 110(48): 19324-19329.

[29] THAKARE D, ZHANG J, WING R A, COTTY P J, SCHMIDT M A. Aflatoxin-free transgenic maize using host-induced gene silencing.Science Advances, 2017, 3(3): e1602382.

[30] BLUHM B H, ZHAO X, FLAHERTY J E, XU J R, DUNKLE L D.regulates growth and pathogenesis in. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2007, 20(6): 627-636.

[31] JIANG J, LIU X, YIN Y, MA Z. Involvement of a velvet protein FgVea in the regulation of asexual development, lipid and secondary metabolisms and virulence in. PLoS ONE, 2011, 6(11): e28291.

[32] ADáM A L, KOHUT G, HORNOK L., a hog-type map kinase gene, is involved in multistress response in. Journal of basic microbiology, 2010, 48(3): 151-159.

[33] COLABARDINI A C, BROWN N A, SAVOLDI M, GOLDMAN M H S, GOLDMAN G H. Functional characterization of, a homologue of the mammalian kinase SGK. PLoS ONE, 2013, 8(3): e57630.

[34] CHOI Y E, SHIM W B. Functional characterization of, a gene encoding a putative protein phosphatase 2A catalytic subunit. Microbiology, 2008, 154(1): 326-336.

[35] EATON C J, CABRERA I E, SERVIN J A, WRIGHT S J, COX M P, BORKOVICH K A. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in. PLoS ONE, 2012, 7(10): e48026.

[36] VIJAI B, SABINE B, ALBERT V, GOPALAN S, WEI Y D. Alanine: glyoxylate aminotransferase 1 is required for mobilization and utilization of triglycerides during infection process of the rice blast pathogen,. Plant Signaling & Behavior, 2012, 7(9): 1206-1208.

[37] NGUYEN L N, J?RG B, LE G T, ST?RKEL C, SCH?FER W. Autophagy-related lipase FgATG15 ofis important for lipid turnover and plant infection. Fungal Genetics and Biology, 2011, 48(3): 217-224.

[38] ZHANG H, GUO J, VOEGELE R T, ZHANG J, DUAN Y, LUO H, KANG Z. Functional characterization of calcineurin homologs pscna1/pscnb1 inf sp tritici using a host-induced rnai system. PLoS ONE, 2012, 7(11): e49262.

[39] DUYVESTEIJN R G E, WIJK R V, BOER Y, REP M, HARING M A. Frp1 is af-box protein required for pathogenicity on tomato. Molecular Microbiology, 2005, 57(4): 1051-1063.

[40] LAMOTH F, JUVVADI P R, FORTWENDEL J R, STEINBACH W J. Heat shock protein 90 is required for conidiation and cell wall integrity in. Eukaryotic Cell, 2012, 11(11): 1324-1332.

[41] ZHAO P B, REN A Z, XU H J, LI D C. The gene, encoding a camp-dependent protein kinase catalytic subunit homolog, is required for hyphal growth, spore germination, and plant infection in. Journal of Microbiology & Biotechnology, 2010, 20(1): 208.

[42] WORIEDH M, HAUBER I, MARTINEZ-ROCHA A L, VOIGT C, MAIER F J, SCHR?DER M, MEIER C, HAUBER J, SCH?FER W. Preventing fusarium head blight of wheat and cob rot of maize by inhibition of fungal deoxyhypusine synthase. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2011, 24(5): 619-627.

[43] CHEN J, DING J, LI H, LI Z, SUN X, LI J, WANG R, DAI X, DONG H, SONG W, CHEN W, XIA Z, WU J. Detection and verification of quantitative trait loci for resistance to Fusarium ear rot in maize. Molecular Breeding, 2012, 30(4): 1649-1656.

[44] MU C, GAO J, ZHOU Z, WANG Z, SUN X, ZHANG X, DONG H, HAN Y, LI X, WU Y, SONG Y, MA P, DONG C, CHEN J, WU J. Genetic analysis of cob resistance to: another step towards the protection of maize from ear rot. Theoretical and applied genetics, 2019, 132(4): 1049-1059.

[45] DOLORES B R, FERNANDO C G, CARLOS L G A, ANTONIO R H, VICTOR H A R, JOSE L C S. Responses of maize landrace seedlings to inoculations ofspp. Open Access Library Journal, 2017, 4(6): 1-14.

[46] JU M, ZHOU Z, MU C, ZHANG X, GAO J, LIANG Y, CHEN J, WU Y, LI X, WANG S, WEN J, YANG L, WU J. Dissecting the genetic architecture of Fusarium verticillioides seed rot resistance in maize by combining QTL mapping and genome-wide association analysis. Scientific Reports, 2017, 7: 46446.

resistant maize inbred line development using host-Induced gene silencing technology

HE Kewei1, CHEN Jiafa2, ZHOU Zijian2, WU Jianyu1,2

1College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2College of Life Sciences of Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002

【】() is a common pathogen, which can cause ear rot, stalk rot, seedling blight, and seed rot in maize. These diseases caused bynot only affected the yield and quality of maize, but also seriously threatened to the safety of human and livestock by a variety of fungal toxins such as fumonisin which produced during the metabolic process of the pathogen. So far, there is no report about the major resistance gene cloned and utilized forin maize. Using host-induced gene silencing technology provides a new strategy for resistance breeding in maize. 【】 Key genes associated with thedevelopment were cloned using homologous gene sequence method, and the dsRNA were produced by in-vitro transcription (IVT) assay. The dsRNA for different genes was premixed with suspension spores ofused for RNA silencing experiment in vitro. For investigate the degree of disease, the seeds of the susceptible inbred line Xi502 were sterilized and inoculated, and then were cultured in a petri dish at 28℃ in the dark for 48 h. For investigate the incidence of the seeds after inoculation, glucose was added to the spore suspension mixed with dsRNA, then spore germination and mycelia growth were observed under the microscope after 25℃ culture for 24 h. The Xi502 seedlings of the trifoliate stage were transferred to the spore suspension with premixed dsRNA for culture, and the incidence of seedlings blight was observed after 7 days. In order to select the target gene for HIGS, combine the seed morphological observation result after inoculation and seedling inoculation result. Then, the silent vector about these key target genes were constructed and transferred into the susceptible inbred line Xi502. The transgenic seeds were evaluated by artificial inoculation. The total RNA of the transgenic seeds after inoculation was extracted, and the relative expression of target genes inwas analyzed by qRT-PCR to determine the silencing effect of HIGS line. 【】Eighteen candidate genes related to growth were cloned by homologous cloning method in. It was found that the disease level of seeds was significantly reduced after 11 candidate genes silencing by seed inoculation experiments. Furthermore, six of the 11 candidate target genes,,,,,, and, were found that response to the spore germination and mycelium growth after gene silencing. Finally, based on the results of seedling inoculation, 3 silencing target genes,andwith significant inhibitory effect in vitro were selected. Then the silencing vector was constructed by combine three specific segments from the three target genes, transgenic plants were obtained. It was found that the resistance level was highly increased in T2-generation seeds compared to the none-transgenic plants. As well as the expression levels of all the three target genes were significantly decreased in. 【】Three genes,,and, are important for development of. By constructing transgenic HIGS plants for target gene,and, the increase the resistance toin maize.

maize (L);; host-induced gene silencing; transgenic; ear rot

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.002

2020-03-16；

2020-05-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（31761143009，U1704105）

郝可偉，E-mail：544220111@qq.com。通信作者周子鍵，E-mail：zhouzijian19900601@163.com。通信作者吳建宇，E-mail：wujianyu40@126.com

（責(zé)任編輯 李莉）