束婧婷，姬改革，單艷菊，章明，巨曉軍，劉一帆，屠云潔，盛中偉，唐燕飛，蔣華蓮，鄒劍敏

IGF1-PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因在黃羽肉雞肌肉和肝臟中的表達(dá)

束婧婷1，姬改革1，單艷菊1，章明1，巨曉軍1，劉一帆1，屠云潔1，盛中偉1，唐燕飛2，蔣華蓮2，鄒劍敏1

1江蘇省家禽科學(xué)研究所/江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225125；2廣西富鳳農(nóng)牧集團(tuán)有限公司，南寧 530024

【】IGF1-PI3K-Akt信號通路是調(diào)控生長發(fā)育的關(guān)鍵通路，選擇慢速型的廣西麻雞和中速型的花山麻雞作為研究對象，探究IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因胰島素樣生長因子1( Insulin-like growth factors, IGF1)、胰島素樣生長因子1受體( Insulin- like growth factor receptor, IGF1R)和胰島素受體底物1 (Insulin receptor substrate1, IRS1)在骨骼肌和肝臟中的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律，為闡明黃羽肉雞生長發(fā)育調(diào)控機(jī)理提供參考。采用SPSS20.0比較廣西麻雞和花山麻雞在胚胎期至出生后早期的生長發(fā)育差異，采用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測上述3個基因在兩個品種雞胚胎期（9、12、16胚齡）和出生后（0、7、21、35、49和63日齡）胸肌、腿肌和肝臟中的表達(dá)差異，并將其與體重和組織重進(jìn)行相關(guān)性分析。雞生長發(fā)育早期體重、骨骼肌重和肝臟重變化呈現(xiàn)顯著的品種和時間特異性，經(jīng)過選育的花山麻雞體重和組織重的增長在胚胎發(fā)育后期已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過廣西麻雞。IGF1、IGF1R和IRS1基因表達(dá)存在顯著的品種、組織和發(fā)育時段特異性，總體上，在胚胎期肌肉中的表達(dá)量高于肝臟組織，出生后則為肝臟中的表達(dá)量高于肌肉組織，廣西麻雞肌肉中的表達(dá)量高于花山麻雞，而花山麻雞肝臟中的表達(dá)量要高于廣西麻雞。IGF1基因在兩個品種胸腿肌中均在9胚齡即可檢測到表達(dá)，腿肌中表達(dá)量均是9胚齡時最高，除與12胚齡差異不顯著外，與其他各階段差異顯著，表達(dá)量最低點(diǎn)出現(xiàn)在出雛0日齡時；胸肌中則是12胚齡時表達(dá)量最高，63日齡時最低；肝臟中則出現(xiàn)品種差異，廣西麻雞胚胎期未檢測到表達(dá)，從出雛0日齡開始表達(dá)，表達(dá)高峰出現(xiàn)在21日齡時，而在花山麻雞中雖然胚胎期檢測到表達(dá)但表達(dá)量極低，49日齡時達(dá)到表達(dá)高峰。兩品種雞肌肉和肝臟各個階段均檢測到IGF1R mRNA的表達(dá)，在胸肌和腿肌中的表達(dá)量均表現(xiàn)為9胚齡最高，廣西麻雞9胚齡與其他各階段差異顯著，花山麻雞9胚齡除與12胚齡差異不顯著外，與其他各階段均差異顯著；肝臟中，廣西麻雞表達(dá)高峰出現(xiàn)在21日齡，且與9、12、16胚齡和0日齡差異顯著，花山麻雞則是63日齡時最高，與其他各階段差異顯著。兩品種雞肌肉和肝臟各個階段均能檢測到IRS1 mRNA的表達(dá)，在兩品種肌肉中的表達(dá)量均表現(xiàn)為9胚齡或者12胚齡最高，與其他各階段差異顯著，隨后下降，并在出雛后維持在較低水平；肝臟中IRS1的表達(dá)模式與IGF1R一致。IGF1、IGF1R和IRS1基因的表達(dá)兩兩之間均表現(xiàn)出顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系，同時，肌肉中3個基因的表達(dá)與體重、胸（腿）肌重存在顯著的負(fù)相關(guān)，而肝臟中3個基因的表達(dá)與體重、胸（腿）肌重、肝臟重均存在顯著的正相關(guān)。IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因之間存在一致性趨勢，品種間和組織間表達(dá)量的差異可能正是不同類型黃羽肉雞生長發(fā)育差異的主要原因之一。

黃羽肉雞；基因表達(dá)；IGF1-PI3K-Akt信號通路; 肌肉；肝臟

0 引言

【研究意義】禽類的生長發(fā)育是一個復(fù)雜的生理過程，不同生長階段體重以及肌肉的生長速度與強(qiáng)度在不同品種以及不同生長環(huán)境之間有著較大差異，不同遺傳背景對禽類的生長以及肌肉的產(chǎn)量有著重要影響[1-2]。研究表明，骨骼肌的“肥大”/“萎縮”，是由蛋白質(zhì)合成/降解之間的平衡來控制的。IGF1-PI3K- Akt信號通路既參與蛋白質(zhì)的合成又參與蛋白質(zhì)的降解，對骨骼肌的發(fā)育、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化等具有極其重要的作用[3-4]，是調(diào)控生長發(fā)育的關(guān)鍵通路，肌肉的生長發(fā)育與 IGF1-PI3K-Akt通路相關(guān)基因的時空特異性表達(dá)密切相關(guān)[5-7]。探究IGF1-PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因在不同黃羽肉雞品種（系）肝臟和骨骼肌中的表達(dá)差異對于闡明黃羽肉雞肌肉生長發(fā)育分子機(jī)理具有重要意義，將有助于了解雞生長過程中激素調(diào)控的本質(zhì)。【前人研究進(jìn)展】IGFs系統(tǒng)由3個配體（IGF1，IGF2和胰島素），3個受體（IGF1R，IGF2R和胰島素受體IR）和6種結(jié)合蛋白（IGFBPs 1–6）組成[8]。IGF1是動物體內(nèi)最重要的生長因子之一，IGF1可以通過IGF1-PI3K-Akt信號通路促進(jìn)骨骼肌干細(xì)胞的增殖、肌細(xì)胞的分化以及成肌細(xì)胞融合為肌管[3,9]，對動物胚胎以及出生后的生長發(fā)育有重要作用。肝臟是產(chǎn)生IGF1的主要場所，但許多組織細(xì)胞均可產(chǎn)生IGF1和IGF2，從而發(fā)揮自分泌和旁分泌作用。IGF1促進(jìn)細(xì)胞生長的長期效應(yīng)主要是通過IGF1R介導(dǎo)的[10-11]。IGF1R是一個2型絡(luò)氨酸激酶跨膜糖蛋白受體，通常以包含2個細(xì)胞外α亞基和2個跨膜β亞基的異源二聚體的形式存在[12]。肌肉中IGF1R活性的喪失將導(dǎo)致肌纖維數(shù)目的減少和直徑變小，從而影響骨骼肌的生長發(fā)育[13]。胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）是一種信號傳導(dǎo)蛋白，廣泛分布于胰島素敏感組織中。IRS1是IRS家族最早發(fā)現(xiàn)的成員，是胰島素信號通路的重要中間體，調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)肌細(xì)胞的生長、增殖和分化。IRS1是IGF1的主要底物，處于IGF1R的下游，IGF1配體通過結(jié)合α亞基從而激活β亞基的內(nèi)源酪氨酸激酶活性，進(jìn)而結(jié)合并激活I(lǐng)RS和Shc，磷酸化的IRS1通過結(jié)合PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基進(jìn)一步激活PI3K-AKT-mTOR信號通路。在小鼠中，敲除 IRS1下調(diào) IGF1的表達(dá)[14]和導(dǎo)致體重減輕 40%—70%[15]。在雞上，在成肌細(xì)胞中過表達(dá)和敲低 IRS1，發(fā)現(xiàn)IRS1可以促進(jìn)細(xì)胞增殖[16]。由此可見，IRS1是IGF1-PI3K-AKT通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在 IGF1 信號通路的作用十分重要，可直接影響 IGF1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控肌肉的生長?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因IGF1、IGF1R和IRS1對肌肉的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，目前關(guān)于這些基因在不同生長速度的黃羽肉雞（廣西麻雞和花山麻雞）不同部位肌肉和肝臟中表達(dá)情況還沒有文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】黃羽肉雞按生長速度分為慢速型、中速型和快速型。廣西麻雞是我國重要的慢速型地方品種，其肉質(zhì)鮮美，深受廣大消費(fèi)者歡迎，但其生長速度較慢（120日齡上市，平均上市體重1.5 kg）?；ㄉ铰殡u是利用快大型肉雞和黃羽肉雞雜交培育而成的適合屠宰后冷鮮上市的中速型黃羽肉雞配套系（63—65日齡上市，平均上市體重1.9 kg），具有屠體美觀、生長速度快、肉質(zhì)較優(yōu)等優(yōu)點(diǎn)。本研究即以慢速型的廣西麻雞和中速型的花山麻雞作為研究對象，研究其從胚胎期至出生后早期的生長發(fā)育特點(diǎn)，以及IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因IGF1、IGF1R和IRS1在胸腿肌和肝臟中的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步闡明IGF1-PI3K-AKT信號通路影響黃羽肉雞肌肉發(fā)育的分子機(jī)理提供一定的參考，為黃羽肉雞“分子編寫育種”提供一定的遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時間、地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2019年4—8月在揚(yáng)州江蘇省家禽科學(xué)研究所養(yǎng)殖基地和家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)動物

廣西麻雞種蛋來源于廣西富鳳農(nóng)牧有限公司廣西麻雞保種群，花山麻雞種蛋來源于江蘇興牧農(nóng)業(yè)科技有限公司育種群。種蛋孵化前，進(jìn)行稱重、消毒和編號，品種內(nèi)蛋重變異系數(shù)在5%以內(nèi)。2個品種種蛋隨機(jī)置入同一孵化箱，在相同條件下（溫度為37.5—37.8℃，相對濕度為65%—75%）同時孵化。出雛后，在統(tǒng)一的條件下飼養(yǎng)至63日齡。種蛋入孵后的24 h設(shè)定為1胚齡，分別于9個時間點(diǎn)（9胚齡、12胚齡、16胚齡和出雛后0日齡、7日齡、21日齡、35日齡、49日齡和63日齡）采樣，胚胎期種蛋用解剖刀刀柄敲碎鈍端蛋殼，以無菌鑷子移去蛋殼，換一無菌鑷子輕夾胚胎頸部取出雞胚放置準(zhǔn)備好的吸水紙上，然后移至稱量紙記錄胚重（或體重），將一側(cè)腿去爪后帶骨稱重，一側(cè)胸帶骨分離并稱重。采集另一側(cè)胸大肌和腿肌同一部位組織樣品，采集肝臟稱重后，置于液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。每個時間點(diǎn)每個品種采樣20只，胚胎期利用CHD1基因多態(tài)性鑒別公母，出雛后根據(jù)性腺組織判別公母。性別鑒定后，每個時間點(diǎn)每個品種選取母雞6只用于測定。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

肌肉總RNA提取按TRNzol Universal 總RNA提取試劑（DP424）（天根，北京）的說明書進(jìn)行。RNA樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性后，采用核酸定量儀NanoDrop2000（Thermo scientific，美國）測定濃度及根據(jù)A260nm/A280nm值確定RNA純度。取2 μg總RNA，按照cDNA 第一鏈合成試劑盒HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（R323-01）（諾唯贊，南京）的使用說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，RT產(chǎn)物保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)

選擇雞肌肉特異性內(nèi)參基因HSP70作為本研究的內(nèi)參基因[17]。根據(jù)GenBank中雞的IGF1 (GenBank登錄號：NM_001004384.2)和 IGF1R (GenBank登錄號：NM_205032.1 )相關(guān)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，IRS1引物參考LI等[16]報(bào)道的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海英俊生物工程有限公司合成，引物信息見表1。

表1 基因引物序列

1.5 實(shí)時熒光定量PCR

熒光定量PCR采用SYBR Green Ι法，參照ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Q411-02）（諾唯贊，南京）試劑盒說明書進(jìn)行。將每個待測樣品cDNA產(chǎn)物取等體積混合后，用混合樣做模板，對實(shí)時熒光定量PCR的退火溫度、引物濃度、模板濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。20 μL的反應(yīng)體系如下：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，50×ROX Reference Dye2 0.4 μL，模板2 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 10 s，55℃或60℃ 30 s，95℃ 15 s，40個循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。每次反應(yīng)均設(shè)空白樣品為陰性對照，每個樣品設(shè)置3個平行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行處理，分析基因的相對表達(dá)量。將廣西麻雞0日齡設(shè)為對照組，ΔΔCt=ΔCt（其他日（胚）齡）-ΔCt（0日齡）。采用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，組間差異顯著性用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Bivariate Correlation用來分析基因表達(dá)之間以及基因表達(dá)與生長發(fā)育相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)以Mean ± SE表示，＜0.05，表示差異顯著；＜0.01，表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 生長速度不同的兩個品種雞生長發(fā)育過程中體重、肌肉和肝臟的發(fā)育性變化

兩個品種雞生長發(fā)育過程中體重的變化如圖1-A所示，兩個品種體重均呈持續(xù)上升態(tài)勢，存在顯著的胚齡（日齡）和品種效應(yīng)。在所研究的9個發(fā)育階段，花山麻雞胚重（體重）均高于廣西麻雞，除在9和12胚齡差異不顯著外（＞0.05），其他胚齡（日齡）均達(dá)到顯著水平（＜0.05或＜0.01），尤其表現(xiàn)在出雛后，花山麻雞體重的增長速度遠(yuǎn)快于廣西麻雞。兩個品種胸肌重的變化趨勢基本一致（圖1-B），都是隨著胚齡（日齡）的增長，胸肌重量逐漸增加，值得指出的是，在0日齡（出雛）時，兩個品種的胸肌重均顯著下降，顯著低于16胚齡時的胸肌重（＜0.05），與12胚齡時的胸肌重量無顯著差異（＞0.05），從7日齡開始，花山麻雞的胸肌重均顯著高于廣西麻雞（＜0.05或＜0.01）。兩個品種腿肌重隨日齡的增長持續(xù)增加（圖1-C），品種間比較發(fā)現(xiàn)，總體上花山麻雞的腿肌重要高于廣西麻雞，在胚胎期差異不顯著，從出雛開始即表現(xiàn)出顯著的差異（＜0.05或＜0.01）。兩個品種肝臟重的變化趨勢基本一致（圖1-D），從16胚齡到63日齡，兩個品種雞肝臟重顯著（＜0.05）遞增；品種間比較發(fā)現(xiàn)，在胚胎期以及出雛時，兩個品種雞肝臟重相差不顯著（＞0.05），從7日齡開始，花山麻雞肝臟重顯著（＜0.05）或極顯著（＜0.01）高于廣西麻雞。

A：體重；B：胸肌重；C：腿肌重；D：肝臟重。ed表示胚齡，d表示日齡；品種內(nèi)不同胚齡或日齡比較，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），相同小寫字母表示差異不顯著（P＞0.05）*表示同一胚齡的不同品種間差異顯著（P＜0.05），**表示同一胚齡的不同品種間差異極顯著（P＜0.01）

2.2 IGF1基因在不同雞種胚胎期和出生后早期胸肌、腿肌和肝臟中的表達(dá)規(guī)律

IGF1基因在廣西麻雞和花山麻雞不同發(fā)育階段胸肌、腿肌和肝臟中的表達(dá)存在顯著的胚（日）齡、組織和品種效應(yīng)，結(jié)果見表2。胸肌中，兩個品種雞IGF1 mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)模式，在9胚齡時表達(dá)量較高，到12胚齡達(dá)到最高，顯著高于后續(xù)的胚（日）齡（＜0.05），隨后顯著下降（＜0.05），并在后續(xù)的發(fā)育階段均維持在較低的水平，63日齡表達(dá)量最低。在腿肌中，兩個品種IGF1 mRNA的表達(dá)變化趨勢較為一致，在9胚齡時表達(dá)量最高，9胚齡至12胚齡基本保持穩(wěn)定，隨后顯著下降（＜0.05），至出雛時降至最低，7日齡開始回升，隨后21日齡至63日齡基本保持穩(wěn)定。在肝臟中，廣西麻雞IGF1 mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)模式，胚胎期未檢測到表達(dá)，出雛即有表達(dá)，隨后升高，至21日齡達(dá)到表達(dá)高峰，相對表達(dá)量為7日齡時的14倍（＜0.05），隨后維持在較高的表達(dá)水平，但63日齡又有顯著下降（＜0.05）?；ㄉ铰殡u肝臟中IGF1 mRNA的表達(dá)同樣呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)模式，在胚胎期表達(dá)量極低，9—16胚齡僅微量表達(dá)，出雛時顯著升高（＜0.05），隨后持續(xù)升高，至21日齡表達(dá)量顯著上調(diào)（＜0.05），相對表達(dá)量達(dá)到7日齡時的13倍，接著繼續(xù)上升，至49日齡時達(dá)到表達(dá)高峰后基本保持穩(wěn)定。

品種間比較發(fā)現(xiàn)，在胸腿肌中，IGF1 mRNA在廣西麻雞胚胎期至出雛的表達(dá)量都顯著（＜0.05）或極顯著（＜0.01）高于花山麻雞，而出雛后至63日齡，兩者差異不顯著（＞0.05）；而在肝臟中IGF1基因則是在花山麻雞中的表達(dá)要高于廣西麻雞，且除7日齡差異不顯著（＞0.05）外，其他日（胚）齡均達(dá)到了顯著水平（＜0.05）。組織間比較發(fā)現(xiàn)，兩品種腿肌中IGF1基因各階段的表達(dá)量均高于胸肌組織，在胚胎期，肌肉中IGF1基因的表達(dá)量均高于肝臟，而在出雛后的各發(fā)育階段，肝臟中IGF1基因的表達(dá)量要高于肌肉組織，且在肝臟和肌肉中的表達(dá)量變化規(guī)律截然相反。

2.3 IGF1R基因在不同雞種胚胎期和出生后早期胸肌、腿肌和肝臟中的表達(dá)規(guī)律

IGF1R基因在廣西麻雞和花山麻雞不同發(fā)育階段胸肌、腿肌和肝臟中的表達(dá)存在顯著的胚（日）齡、組織和品種效應(yīng)，結(jié)果見表2。IGF1R基因在兩個品種胸肌中的表達(dá)變化趨勢較為一致，在9胚齡時表達(dá)量最高，到12胚齡顯著下調(diào)（＜0.05），16胚齡略有升高后持續(xù)下調(diào)，7日齡下降幅度最大，達(dá)到顯著水平（＜0.05），然后在整個出生后早期表達(dá)量均維持在極低水平，值得指出的是，IGF1R基因在花山麻雞所研究的發(fā)育階段胸肌中的表達(dá)量均極低。IGF1R基因在兩個品種腿肌中的表達(dá)模式較為一致，在9胚齡時表達(dá)量最高，在廣西麻雞中要顯著高于其他胚（日）齡（＜0.05），而花山麻雞中除了與12胚齡差異不顯著外（＞0.05），與其他胚（日）齡的表達(dá)量均達(dá)到顯著水平（＜0.05），隨后持續(xù)下降，在出雛后的各個發(fā)育階段表達(dá)量均極低。在肝臟中，廣西麻雞IGF1R 基因的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)模式，在9胚齡時表達(dá)量最低，然后持續(xù)升高至21日齡達(dá)到表達(dá)高峰后略有下降，但基本保持穩(wěn)定，總體上出雛（0日齡）及出雛后的表達(dá)量顯著高于胚胎期（＜0.05），21日齡表達(dá)量顯著高于0日齡（＜0.05），而與其他日齡差異不顯著（＞0.05）；花山麻雞IGF1R 基因的表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)升高的表達(dá)趨勢，9胚齡表達(dá)量最低，隨后升高，但整個胚胎期表達(dá)量差異不顯著（＞0.05），出雛時顯著升高（＜0.05），隨后持續(xù)升高，至63日齡時達(dá)到表達(dá)高峰，表達(dá)量顯著高于其他日（胚）齡（＜0.05），總體上出雛（0日齡）及出雛后的表達(dá)量顯著高于胚胎期（＜0.05）。

品種間比較來看，總體上，IGF1R基因在廣西麻雞胸腿肌中的表達(dá)量要高于花山麻雞，在胚胎期至出雛達(dá)到顯著（＜0.05）或極顯著（＜0.01）水平，而出雛后品種間差異不顯著（＞0.05）；而在肝臟中的表達(dá)量則是花山麻雞高于廣西麻雞，在49和63日齡達(dá)到顯著水平（＜0.05）。組織間比較發(fā)現(xiàn)，總體上兩品種腿肌中IGF1R基因的表達(dá)量高于胸肌組織，胚胎期至出雛（0日齡），肌肉中IGF1R基因的表達(dá)量要高于肝臟，而在出雛后的各發(fā)育階段，肝臟中IGF1R基因的表達(dá)量要高于肌肉組織，且肝臟和肌肉中的表達(dá)量變化規(guī)律在胚胎期和出生后早期截然相反。

2.4 IRS1基因在不同雞種胚胎期和出生后早期胸肌、腿肌和肝臟中的表達(dá)規(guī)律

IRS1基因在廣西麻雞和花山麻雞不同發(fā)育階段胸肌、腿肌和肝臟中的表達(dá)存在顯著的胚（日）齡、組織和品種效應(yīng)，結(jié)果見表2。在胸肌中，IRS1基因在兩品種雞中的表達(dá)趨勢較為一致，在9胚齡時表達(dá)量最高，在胚胎期至出雛基本維持穩(wěn)定，到7日齡顯著下降（＜0.05），隨后均維持在較低水平。在腿肌中，IRS1基因在廣西麻雞中呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)的表達(dá)趨勢，9胚齡時表達(dá)量最高，并顯著高于其他胚（日）齡（＜0.05），隨后逐漸降低并保持在相對平穩(wěn)表達(dá)狀態(tài)，63日齡表達(dá)量最低；IRS1基因在花山麻雞中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在12胚齡時達(dá)到峰值，之后顯著降低（＜0.05）并保持平穩(wěn)表達(dá)狀態(tài)，9胚齡，12胚齡表達(dá)量顯著高于其他胚（日）齡（＜0.05），其他胚（日）齡間表達(dá)量差異不顯著（＞0.05）。在肝臟中，廣西麻雞IRS1 基因的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)模式，在9胚齡時表達(dá)量最低，然后持續(xù)升高至21日齡達(dá)到表達(dá)高峰后略有下降，但基本保持穩(wěn)定，總體上出雛（0日齡）及出雛后的表達(dá)量顯著高于胚胎期（＜0.05），21日齡表達(dá)量顯著高于0日齡（＜0.05），而與其他日齡差異不顯著（＞0.05）；花山麻雞IRS1基因的表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)升高的表達(dá)趨勢，至63日齡時達(dá)到表達(dá)高峰，表達(dá)量顯著高于其他日（胚）齡（＜0.05），總體上出雛（0日齡）及出雛后的表達(dá)量顯著高于胚胎期（＜0.05），胚胎期各胚齡間表達(dá)量差異不顯著（＞0.05），而出雛后各日齡間差異均達(dá)到顯著水平（＜0.05）。

品種間比較來看，總體上，IGF1R基因在廣西麻雞胸腿肌中的表達(dá)量要高于花山麻雞，在胚胎期至出雛達(dá)到顯著（＜0.05）水平，而出雛后胸肌中除63日齡差異顯著（＜0.05）外，其他日齡點(diǎn)差異均不顯著（＞0.05），腿肌中除7日齡和21日齡差異顯著（＜0.05）外，其他日齡點(diǎn)差異均不顯著（＞0.05）。組織間比較發(fā)現(xiàn)，總體上兩品種腿肌中IRS1基因的表達(dá)量高于胸肌組織，胚胎期至出雛（0日齡），肌肉中IRS1基因的表達(dá)量要高于肝臟，而在出雛后的各發(fā)育階段，肝臟中IRS1基因的表達(dá)量要高于肌肉組織，且肝臟和肌肉中的表達(dá)量變化規(guī)律在胚胎期和出生后早期截然相反。

表2 廣西麻雞和花山麻雞不同發(fā)育時期骨骼肌和肝臟中IGF1、IGF1R和IRS1基因的相對表達(dá)量

GXMJ代表廣西麻雞，HSMJ代表花山麻雞；同一品種不同胚齡或日齡間比較，字母不同表示差異顯著（＜0.05）；同一組織相同胚齡不同品種間比較，*表示差異達(dá)顯著水平（＜0.05），**表示差異達(dá)極顯著水平（＜0.01）

GXMJ represents Guangxi partridge chickens, while HSMJ represents Huashan partridge chickens. In the same breed, values with different lower case letter are significantly different (＜0.05) between different embryo age; in the same embryo age, * indicates there is significantly different between breeds in the same tissue (＜0.05), and **indicates there is extremely significantly different (＜0.01)

2.5 IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性

為深入了解IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因在雞骨骼肌和肝臟早期發(fā)育過程中的相互作用機(jī)制，對IGF1，IGF1R以及IRS1基因在廣西麻雞和花山麻雞胸腿肌和肝臟中的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析見表3。由表可見，3個基因在兩品種的胸腿肌和肝臟中均表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系（＜0.01），即IGF1基因與IGF1R 基因表達(dá)水平之間存在極顯著的正相關(guān)（＜0.01），IGF1和IRS1 基因表達(dá)水平之間存在極顯著的正相關(guān)（＜0.01），IGF1R 和 IRS1基因表達(dá)水平之間存在極顯著的正相關(guān)（＜0.01），這些結(jié)果表明所研究的IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因之間存在顯著的正調(diào)控關(guān)系。

2.6 IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因表達(dá)量與生長性狀的相關(guān)性

IGF1-PI3K-AKT信號通路對于動物的生長發(fā)育起到重要作用，但在不同物種中其作用方式也不同，目前在黃羽肉雞中尚未見該信號通路對生長發(fā)育作用的系統(tǒng)報(bào)道，故本研究進(jìn)一步對IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因表達(dá)量與體重等生長性狀的相關(guān)性進(jìn)行了分析，詳見表4。由表可見，IGF1，IGF1R以及IRS1基因在兩個品種雞胸肌和腿肌中的表達(dá)量均與體重、胸（腿）肌重呈顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)（＜0.05 or＜0.01），而在肝臟中的表達(dá)量與體重、胸肌重、腿肌重、肝臟重呈顯著或極顯著的正相關(guān)（＜0.05 or＜0.01）。

表3 廣西麻雞和花山麻雞骨骼肌和肝臟中IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性

**表示極顯著相關(guān)（＜0.01） ** shows that there are extreme significant relationship between two different index (＜0.01)

表4 不同雞種IGF1-PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因表達(dá)量與生長性狀的相關(guān)性

*表示顯著相關(guān)（0.01＜＜0.05）；**表示極顯著相關(guān)（＜0.01）

* shows that there are significant relationship between two different index (0.01＜＜0.05); ** shows that there are extreme significant relationship between two different index (＜0.01)

3 討論

黃羽肉雞是我國傳統(tǒng)消費(fèi)習(xí)慣形成的特殊消費(fèi)食品，現(xiàn)已成為優(yōu)質(zhì)肉雞的代名詞，按生長速度可分為快速型（50—60 d出欄）、中速型（60—90 d出欄）和慢速型（90 d以上出欄）。黃羽肉雞肉質(zhì)好，但生長速度慢，產(chǎn)肉量少，因此，如何提高黃羽肉雞產(chǎn)肉量和生產(chǎn)效率，是國內(nèi)肉雞育種工作者急需解決的問題。本研究選用慢速型的廣西麻雞和中速型的花山麻雞作為研究黃羽肉雞肌肉生長發(fā)育的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)在所研究的發(fā)育階段，兩個品種的體重、腿肌重和肝臟重均呈持續(xù)增長趨勢，而胸肌重則在胚胎發(fā)育晚期出現(xiàn)負(fù)增長現(xiàn)象，與課題組在清遠(yuǎn)麻雞上的研究結(jié)果一致[17]，也與禽類孵化后期組織和器官發(fā)育特點(diǎn)相符，即家禽孵化后期，由于尿囊的氧供應(yīng)能力及營養(yǎng)供應(yīng)達(dá)到極限，機(jī)體需要進(jìn)行糖酵解、糖異生等糖代謝提供能量，因此，此階段肝臟快速發(fā)育以滿足代謝需要[18]；胸肌是肝臟外糖原貯存的另一重要組織，在孵化后期當(dāng)能量發(fā)生危機(jī)時，胸肌中蛋白質(zhì)發(fā)生動員為糖的異生提供氨基酸底物，因此胚胎晚期鴨[18-20]、火雞[21]等家禽胸肌會出現(xiàn)質(zhì)量減輕。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雞生長發(fā)育早期體重、骨骼肌重和肝臟重變化呈現(xiàn)顯著的品種和時間特異性，經(jīng)過選育的中速型花山麻雞體重和組織重的增長在胚胎發(fā)育后期已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過慢速型的廣西麻雞，說明遺傳背景的差異是影響黃羽肉雞生長發(fā)育的重要因素。

本研究發(fā)現(xiàn)生長速度不同的黃羽肉雞胚胎期和生后期肌肉和肝臟中IGF1-PI3K-Akt通路關(guān)鍵基因IGF1、IGF1R和IRS1的表達(dá)差異?？傮w上，在同一雞種的同一個部位，3個基因的表達(dá)規(guī)律是一致的，在肌肉中表現(xiàn)出胚胎期表達(dá)量較高，出雛后下降的趨勢，而在肝臟中則表現(xiàn)出胚胎期表達(dá)量較低，出雛后快速上調(diào)的趨勢；相關(guān)性分析證實(shí)所研究的基因兩兩之間均存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系（＜0.01），提示所研究的3個基因在雞胚胎期及出生后早期表達(dá)存在一致性，充分說明3個基因在功能上有著密切的關(guān)系。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了前人的研究結(jié)果，IGF1 結(jié)合并激活 IGF1R，IGF1R 活化后，促進(jìn) IRS1 磷酸化，磷酸化的 IRS1 進(jìn)一步激活PI3K和Akt，進(jìn)而使整個 IGF1 信號通路活化[3,9]。

胰島素樣生長因子1（IGF1）是動物體內(nèi)最重要的生長因子之一，動物體內(nèi)近乎所有器官的生長和功能都與其有關(guān)[22]。IGF1 可以通過IGF1/IGF1R/PI3K/ Akt 信號通路促進(jìn)骨骼肌干細(xì)胞的增殖、肌細(xì)胞的分化以及成肌細(xì)胞融合為肌管[3,23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在所研究的發(fā)育階段，骨骼肌中均能檢測到IGF1基因的表達(dá)，總體上胚胎期的表達(dá)水平高于出雛后，然而在兩個品種雞胸肌和腿肌中的表達(dá)趨勢并不一致，胸肌中IGF1表達(dá)高峰出現(xiàn)在12胚齡，腿肌中則在9胚齡即出現(xiàn)表達(dá)高峰，說明9胚齡至12胚齡很可能是雞胸腿肌早期發(fā)育中的一個快速生長點(diǎn)，這一階段是初級纖維形成的時期，IGF1基因在這一階段的高表達(dá)也表明該基因可能對成肌細(xì)胞增殖的作用更大。另外由于胸肌和腿肌的發(fā)育依賴于不同的生肌程序和發(fā)育通路，相對于腿肌而言，胸肌屬于晚熟部位，且胸腿肌在肌纖維類型組成上存在差異[24-25]，這可能是IGF1基因在胸腿肌中的差異表達(dá)原因所在。肝臟是禽類出生后分泌IGF1的主要場所，肝臟中分泌IGF1不足將直接導(dǎo)致機(jī)體循環(huán)中IGF1濃度降低，從而影響動物的生長。本研究中，IGF1在兩品種雞胚胎期肝臟中的表達(dá)量均極低或者無表達(dá)，出雛開始表達(dá)量迅速升高，與KIKUCHI等[26]在雞上的研究結(jié)果一致。IGF1基因的表達(dá)存在品種和組織差異，在胚胎期至出雛，廣西麻雞胸肌和腿肌中的表達(dá)量要顯著高于花山麻雞，出雛后品種間差異不顯著；而在肝臟中IGF1基因在花山麻雞中的表達(dá)量除7日齡外均顯著高于廣西麻雞。組織間比較發(fā)現(xiàn)，胚胎期兩品種雞IGF1表達(dá)量均為腿肌＞胸?。靖闻K，而出雛后則為肝臟＞腿?。拘丶?，該結(jié)果與DUPONT[27]的結(jié)論一致，即禽類胚胎期血液中IGF1的來源與出雛后的來源不同，出生后IGF1的主要來源是肝組織，而在胚胎發(fā)育期間IGF1主要來源于肝外組織。

IGF1R基因在兩品種雞胸肌和腿肌中的表達(dá)趨勢較為一致，均在9胚齡時表達(dá)量最高，然后持續(xù)下降并維持在較低的水平，與本課題組在清遠(yuǎn)麻雞上的研究結(jié)果[17]以及在豬背最長肌上發(fā)現(xiàn)IGF1R mRNA 的表達(dá)隨年（胎）齡增加而減少的結(jié)果[28]一致。在胚胎期至出雛，廣西麻雞胸腿肌中的表達(dá)量均顯著高于花山麻雞，我們推測IGF1R基因跟IGF1基因功能一致，在成肌細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用。在所研究的發(fā)育階段肝臟中均能檢測到IGF1R mRNA的表達(dá)，同樣表現(xiàn)為出生后的表達(dá)量顯著高于胚胎期，兩個品種均是9胚齡時表達(dá)量最低，但高峰期存在品種差異，花山麻雞63日齡最高，與其他各階段差異顯著，廣西麻雞則21日齡時表達(dá)量最高，且總體上花山麻雞中的表達(dá)量要高于廣西麻雞，這也可能與不同生長速度黃羽肉雞的生長發(fā)育規(guī)律有關(guān)，說明肝臟中IGF1R基因及其表達(dá)產(chǎn)物可能對雞的生長發(fā)育有著重要的調(diào)節(jié)作用。

IRS1 在介導(dǎo) IGF1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，是 IGF1對生物機(jī)體肌肉生長、分化調(diào)節(jié)功能的必需蛋白分子[29]。目前對雞IRS1基因及其在不同組織中的表達(dá)規(guī)律等報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，在兩品種雞的各個發(fā)育階段均能檢測到IRS1 mRNA的表達(dá)，且表達(dá)模式存在品種、組織和胚（日）齡差異，在胚胎期胸腿肌中的表達(dá)量要高于出生后，表達(dá)高峰同樣出現(xiàn)在9胚齡或12胚齡，說明IRS1可能對促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖具有重要作用，這也與LI等[16]研究結(jié)論一致。IGF1、IGF1R和IRS1基因在胸腿肌中均表現(xiàn)在9胚齡或12胚齡高表達(dá)，說明這3個基因在骨骼肌纖維的形成過程中發(fā)揮了重要作用。IRS1基因在兩品種雞胚胎期肝臟中的表達(dá)量均維持在較低的水平，9胚齡時表達(dá)量最低，從出雛開始即顯著上調(diào)，廣西麻雞21日齡時表達(dá)量達(dá)到最高，而花山麻雞則到63日齡達(dá)到最高，可能與兩個品種雞的生長發(fā)育規(guī)律相關(guān)。

IGF1、IGF1R和IRS1等3個基因在骨骼肌中的表達(dá)量與兩品種雞的體重和肌肉生長呈顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，再一次說明雞骨骼肌中IGF1-PI3K-Akt通路相關(guān)基因是在促進(jìn)胚胎期肌纖維形成而非肌纖維肥大中發(fā)揮作用。肝臟中3個基因的表達(dá)量與廣西麻雞和花山麻雞的體重、胸肌重、腿肌重以及肝臟重則呈顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系，與榮華等[30]在大圍山微型雞、本課題組在鴨[20]上的研究結(jié)果一致，說明在禽類生長發(fā)育過程中，IGF1信號通路發(fā)揮著重要作用，而肝臟則是重要的分泌器官。為了更深入了解IGF1-PI3K-Akt信號通路基因?qū)Σ煌愋忘S羽肉雞生長發(fā)育的調(diào)控規(guī)律，今后還應(yīng)從蛋白水平上分析基因表達(dá)與生長性狀的關(guān)系。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用實(shí)時熒光定量PCR探究了IGF1-PI3K- Akt信號通路相關(guān)基因IGF1、IGF1R和IRS1在慢速型的廣西麻雞和中速型的花山麻雞不同發(fā)育時段肌肉和肝臟中的表達(dá)量差異，研究結(jié)果表明上述3個基因表達(dá)存在品種、胚（日）齡和組織差異，在相同品種同一組織中表達(dá)模式趨于一致，在肌肉中表現(xiàn)出胚胎期表達(dá)量較高，出雛后下降的趨勢，而在肝臟中則表現(xiàn)出胚胎期表達(dá)量較低，出雛后快速上調(diào)的趨勢，3個基因表達(dá)之間的正相關(guān)關(guān)系也充分說明3個基因在功能上有著密切的關(guān)系，存在正向調(diào)控機(jī)制，而品種間表達(dá)量的差異可能與不同類型黃羽肉雞的生長發(fā)育有關(guān)，提示這3個基因可能對雞生長發(fā)育具有一定的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究IGF1-PI3K-Akt信號通路在黃羽肉雞生長發(fā)育過程中發(fā)揮的功能與表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供了新的思路。

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Expression Analysis of IGF1-PI3K-Akt-Dependent Pathway Genes in Skeletal Muscle and Liver Tissue of Yellow Feather Broilers

1Jiangsu Institute of Poultry Science/Key laboratory for Poultry Genetics and Breeding of Jiangsu Province, Yangzhou 225125, Jiangsu;2Guangxi Fufeng Farm Group Co., Ltd., Nanning 530024

【】IGF1-PI3K-Akt signal pathway have been implicated in the regulation of growth and development of chicken. In the present study, the expression of IGF, IGF1R and IRS1genes of IGF1-PI3K-Akt signal pathway was first studied in skeletal muscle and liver tissues of Guangxi partridge chickens with slow growth rate and Huashan partridge chickens with moderate growth rate, which would provide a reference for clarifying the regulation mechanism of growth and development of yellow feather broilers.【】SPSS20.0 software was used to compare the differences of growth traits between Guangxi partridge chickens and Huashan partridge chickens. Expression ofIGF1, IGF1R and IRS1 was quantified by RT-PCR in the breast muscle (BM), leg muscle (LM) and liver on days 9, 12, and 16 of embryonic development, as well as at 0, 7, 21, 35, 49, and 63 days post-hatching (PH) in the two chicken breeds, and the correlations between the gene expression level and body weight as well as tissue weight were also analyzed by SPSS20.0 software.【】The body weight, skeletal muscle and liver weight of chicken in the early growth development showed significant breed- and age-specificity. The growth of Huashan partridge chickens had far exceeded that of Guangxi partridge chickens from the late embryonic development. The expression patterns of IGF1, IGF1R and IRS1 showed significant differences in breed-, tissue- and age-specific fashion. Overall, the expression levels of the three genes in skeletal muscles of embryonic development were much higher than those in liver; in contrast, the expression levels in liver were higher than those in skeletal muscle at post-hatching development. As for breed, expression levels of the studied genes in skeletal muscle of Guangxi partridge chickens were higher than those in Huashan partridge chickens; in contrast, liver expression levels were higher in Huashan partridge chickens. IGF1 mRNA could be detected as early as on E9 d in the skeletal muscles of both chicken breeds, and the highest level was appeared at this stage in LM, significantly higher than those on the other studied development stages expect on E12 d, and the lowest level was appeared on 0 d at hatching; while in BM, the highest level was appeared on E12 d and lowest level was appeared on 63 d; however, the level of IGF1 mRNA differed between breeds in liver. for Guangxi partridge chickens, the highest level was observed on 21 d and there was no expression during embryonic development, whereas the highest level was found on 49 d and very low level during embryonic development in Huashan partridge chickens. IGF1R mRNA could be detected at the whole studied stages in skeletal muscles and liver of both chicken breeds, and the highest level was appeared on E9 d in both BM and LM, significantly higher than those on the other studied development stages in Guangxi partridge chickens, and significantly higher than those on the other studied development stages expect on E12 d in Huashan partridge chickens. In liver, the highest expression level of IGF1R was detected on 21 d in Guangxi partridge chickens, significantly higher than those on E9 d, E12 d, E16 d and 0 d; while the highest level was found on 63 d and significantly higher than those on the other studied development stages. IRS1 mRNA could also be detected at the whole studied stages in skeletal muscles and liver of both chicken breeds. In skeletal muscles, expression of IRS1 were higher on E9 d or E12 d than any other age, and then decreased with age and kept relative low level during PH development in both breeds. The liver IRS1 expression pattern was consistent with IGF1R in both breeds. Significant positive relationships were observed for the expression of studied genes in BM, LM and liver tissues of both chicken breeds. Meanwhile, the skeletal muscle expression of these three genes were all showed significant negative relationships with body weight and breast (leg) muscle weight, whereas the liver expression of these three genes were all showed significant positive relationships with body weight, breast (leg) muscle weight and liver weight. 【】These results implied that the expression of selected genes that comprise the IGF1-PI3K-Akt pathway existed identical trends, and differential expression between breeds and tissues might be one of the main reasons for the different growth rate of the different types of yellow feather broiler.

yellow feather broiler; gene expression; IGF1-PI3K-Akt pathway; skeletal muscle; liver

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.018

2020-07-28；

2020-10-16

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（20）3003）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-41）、江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉雞）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心（JATS[2019]379）、江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目（PZCZ201728）、江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究課題（JQLAB-ZZ-202001）

束婧婷，E-mail：shujingting@163.com。通信作者鄒劍敏，E-mail：jqszjm@163.com

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