譚 杰 馬添翼 陳愛華 周曉群 劉長琳 葛建龍邊 力 陳四清 王學(xué)江

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 威海市文登區(qū)海洋發(fā)展局 威海 264400；4. 山東省乳山市海洋發(fā)展局 威海 264500；5. 煙臺市海洋經(jīng)濟(jì)研究院 煙臺 264006；6. 五洲豐農(nóng)業(yè)科技有限公司 煙臺 264000)

20 世紀(jì)80 年代，我國初步建立刺參(Apostichopus japonicus)苗種人工繁育技術(shù)，進(jìn)入21 世紀(jì)以來，刺參養(yǎng)殖規(guī)模的持續(xù)擴(kuò)大，拉動(dòng)了刺參苗種生產(chǎn)的快速發(fā)展。21 世紀(jì)初，用于刺參人工繁育的親參主要來源于養(yǎng)殖池塘或者海區(qū)自然成熟的刺參。采用養(yǎng)殖池塘或自然海區(qū)的親參，往往因?yàn)樘鞖庠?，錯(cuò)過親參的采捕時(shí)機(jī)，而且自然成熟的親參成熟時(shí)間晚，苗種上市規(guī)格小，放養(yǎng)后成活率低。為解決這一問題，刺參親參人工促熟技術(shù)逐步建立，通過控制親參培育的水溫和營養(yǎng)條件，來獲得性腺發(fā)育成熟的親參。人工促熟獲得的親參，仍然存在成熟不同步、比自然成熟的親參懷卵量低等問題，為獲得足夠的卵子，通常需要培育大量的親參。

海洋無脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)來控制繁殖行為(Nagaraju, 2011; Tanabe et al,2010)。利用此原理，可通過向甲殼動(dòng)物體內(nèi)注入外源激素來促進(jìn)其性腺發(fā)育。研究表明，5-羥色胺即血清素能促進(jìn)斑節(jié)對蝦(Penaeus mono don)的卵巢組織發(fā)育(Wongprasert et a l, 2006; 溫為庚等, 2009)。Meeratana 等(2006)證實(shí)，血清素能刺激羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)的性腺發(fā)育和排放。本研究以刺參為實(shí)驗(yàn)對象，研究向人工促熟的刺參體內(nèi)注射血清素對刺參繁育效果的影響，為進(jìn)一步完善刺參人工促熟技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)刺參

實(shí)驗(yàn)刺參于2018 年11 月取自山東省乳山市海淵水產(chǎn)養(yǎng)殖公司養(yǎng)殖池塘。挑選2000 頭體格健壯、活力好的刺參作為親參進(jìn)行培育。親參平均體重為(247.6±52.6) g，暫養(yǎng)于12 m3水泥池，水深為1 m。初始時(shí)，以自然水溫培育，當(dāng)水溫降至2℃～3℃，保持此水溫2～3 d，此后以1℃/d 的速率升溫至6℃，恒溫培育6～8 d，再以0.5℃/d 的速率升溫至10℃，恒溫培育6～8 d 后，繼續(xù)以0.5℃/d 的速率升溫至15℃后，恒溫待產(chǎn)。親參培育密度為15～20 頭/m3，培育池內(nèi)的溶氧濃度≥5 mg/L，培育過程中，每日上午換水1 次，每次換水量為池水的50%，所換海水經(jīng)過砂濾處理，每3～5 d 倒池1 次，清洗池底殘餌及糞便。

培育過程中，投喂粉狀飼料和海泥的混合物，其重量比為飼料∶海泥=1∶6～8，每日飼料投喂量為池中親參重量的3%～5%，根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)整。及時(shí)將死亡的親參移出培育池，并記錄每個(gè)實(shí)驗(yàn)組刺參的死亡頭數(shù)。

1.2 血清素配制及注射

血清素購于Sigma 公司。以生理鹽水(NaCl 為0.85%)溶解血清素，配成濃度為100 mg/ml 的工作液。當(dāng)親參培育水溫升至15℃后，將血清素按照20、50、100 和200 μg/g 親參體重的劑量從刺參背部注入體腔，每種注射劑量之后各按每5、10、15 和20 d 再注射1 次，以注射生理鹽水的親參為對照組，以不做處理的為空白組。注射生理鹽水的親參每10 d 注射1 次，每次注射0.2 ml，實(shí)驗(yàn)設(shè)置見表1。每個(gè)培育池設(shè)置2 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組為111 頭或112 頭親參，同一培育池的不同實(shí)驗(yàn)組之間用網(wǎng)隔隔開。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置Tab.1 Experiment design

1.3 繁殖力性狀測定

當(dāng)夜間觀察到大量親參集中在培育池的池角，部分親參在水體表層沿池壁活動(dòng)頻繁，軀體上半部離開池壁不停地?fù)u擺或已出現(xiàn)少量雄參排精時(shí)，每日升高親參培育水溫0.5℃，升至18℃后待產(chǎn)。在2019 年3 月下旬，采用陰干流水升溫的方法刺激親參排放精液和卵子。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置 3 個(gè)平行，每個(gè)平行30 頭親參在0.5 m3塑料水槽中排放。觀察到有雄參排精后，即將排精的雄參移出水槽，統(tǒng)計(jì)每個(gè)水槽中產(chǎn)卵的雌參數(shù)，計(jì)算雌參排放率。待所有雌參停止排卵后，計(jì)算雌參平均產(chǎn)卵量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)測量30 個(gè)卵子的卵徑。2 h 后，計(jì)算受精率。

根據(jù)雌參排放率和平均產(chǎn)卵量，挑選F 組和空白組測定孵化率、幼體體長和附著變態(tài)率。F 組和空白組的受精卵分別在21℃水溫孵化，孵化密度為3 個(gè)/ml。受精48 h 后，統(tǒng)計(jì)孵化率。在統(tǒng)計(jì)受精率和孵化率時(shí)取樣3 次，每次統(tǒng)計(jì)的個(gè)體數(shù)為100 個(gè)。

雌參排放率=(排卵雌參數(shù)/催產(chǎn)親參總數(shù))×100%；受精率=發(fā)生卵裂的受精卵數(shù)/總卵子數(shù)×100%；

孵化率=小耳幼體數(shù)/受精卵數(shù)×100%。

受精卵發(fā)育到小耳幼體后進(jìn)行布池，培育密度為0.15個(gè)/ml。幼體培育時(shí)期，投喂由角毛藻(Chaetoceros muelleri)、小新月菱形藻(Nitzschia closterium)和海洋紅酵母(Rhodotorula bent hica)組成的混合餌料，日投餌4次，小耳幼體、中耳幼體和大耳幼體的日投餌量分別為25000～30000、35000和35000～40000 cells/ml。幼體培育期間不換水，每天加入部分新水，至受精后第9天池內(nèi)水深達(dá)到1 m，每組隨機(jī)抽樣30個(gè)耳狀幼體，在顯微鏡下用目微尺測定其體長。

在小耳幼體進(jìn)行布池的同時(shí)，對F組和空白組進(jìn)行附著變態(tài)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)容器是體積為10 L的消毒處理的塑料桶。實(shí)驗(yàn)采用透明塑料薄膜作為附著基。使用前，塑料薄膜先浸泡于海水中，經(jīng)20×10-6mol/L高錳酸鉀消毒30 min，清水沖洗晾干后使用，塑料薄膜置于桶底。2 個(gè)組各設(shè)置3 個(gè)平行。幼體培育密度為0.15個(gè)/ml，充氣培育。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，桶中加滿海水，以后每天換水1次，每次換水1/2。耳狀幼體期間，每日投喂餌料量和培育池中相同。授精后第10天，開始投喂由海帶(Laminaria)粉和馬尾藻(Sargassum)粉混合制成的配合餌料。授精后第20天，觀察統(tǒng)計(jì)幼體附著變態(tài)的情況，計(jì)算幼體附著變態(tài)率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 親參成活率

各實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組的親參成活率見圖1。從圖1 可以看出，各組親參成活率介于(84.7±6.2)%和(90.1±1.6)%之間，各組之間無顯著差異。

2.2 雌參排放率和產(chǎn)卵量

不同實(shí)驗(yàn)組雌參排放率和產(chǎn)卵量見圖2 和圖3。由圖2 和圖3 可知，對照組雌參排放率最低，為(14.4±1.1)%，空白組為(15.6±2.2)%。注射血清素的所有實(shí)驗(yàn)組雌參排放率均高于對照組和空白組，其中，F(xiàn)、J和 M 組顯著高于對照組和空白組，分別為(33.3±1.9)%、(32.2±2.9)%和(31.1±1.1)%。對照組和空白組雌參排卵量最低，分別為(302.0±73.3)萬粒和(304.0±62.7)萬粒。E、F、I、J、K、L、M、N、O 和P 組顯著高于對照組和空白組(P＜0.05)，其中F 組最高，平均排卵量為(637.0±64.2)萬粒。

按血清素為20 μg/g親參體重進(jìn)行注射的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的雌參排放率和平均排卵量2項(xiàng)指標(biāo)沒有顯著差異。注射劑量為50 μg/g的實(shí)驗(yàn)組中，每20 d注射1次的實(shí)驗(yàn)組的2項(xiàng)繁殖力指標(biāo)顯著低于每10 d注射1次的實(shí)驗(yàn)組。注射劑量為100 μg/g的實(shí)驗(yàn)組中，每20 d注射1次的實(shí)驗(yàn)組的雌參排放率顯著低于每10 d注射1次的實(shí)驗(yàn)組。注射劑量為200 μg/g的實(shí)驗(yàn)組中，每20 d注射1次的實(shí)驗(yàn)組的雌參排放率顯著低于每5 d注射1次的實(shí)驗(yàn)組。

2.3 血清素對卵子和幼體質(zhì)量的影響

F 組和空白組卵徑、受精率、孵化率、幼體體長和附著變態(tài)率見表 2。由表 2 可知，F(xiàn) 組卵子卵徑為(165.0±3.5) μm，大于空白組[(161.7±2.6) μm]。F 組的卵子受精率、受精卵孵化率、9 日齡幼體體長和幼體附著變態(tài)率分別為(93.0±1.5)%、(82.7±1.2)%、(856.0±24.8) μm和(24.0±1.9)%，均低于空白組[分別為(96.3±1.8)%、(85.3±1.8)、(951.3±40.3) μm 和(26.4±1.0)%]，但2 組的上述指標(biāo)無顯著差異。

圖1 注射血清素對親參成活率的影響Fig.1 Effects of serotonin on survival rate of sea cucumbers

圖3 注射血清素對雌參平均排卵量的影響Fig.3 Effects of serotonin on fecundity of female sea cucumber

表2 血清素對刺參卵子與幼體質(zhì)量的影響Tab.2 Effects of serotonin on offspring quality of sea cucumber

3 討論

刺參親參在人工促熟過程中能多次產(chǎn)卵，然而每次是由不同的親參產(chǎn)卵或者同一頭親參多次產(chǎn)卵，目前尚不明確。Liu 等(2015)研究表明，人工促熟的親參經(jīng)過升溫刺激，50%～80%的親參會排放精卵。譚杰等(2020)的研究表明，人工促熟的親參，雌參排放率為6%～16%，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)，人工催產(chǎn)中排放的親參大部分為雄參，排放的雌參所占比例較小，說明雌參性腺發(fā)育同步性較差。通過注射外源激素促進(jìn)刺參性腺發(fā)育，提高雌參性腺發(fā)育同步性，可減少親參培育數(shù)量，降低生產(chǎn)成本；另一方面，雌參排放率提高，可增加繁殖的有效群體數(shù)量，降低近交衰退的風(fēng)險(xiǎn)。

血清素是一種重要的神經(jīng)傳遞素和神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，動(dòng)物通過血清素受體控制著一系列的感覺和運(yùn)動(dòng)功能(Wang et al, 2017)。在甲殼動(dòng)物中，血清素具有促進(jìn)卵黃發(fā)生和卵母細(xì)胞成熟的雙重作用(Tomy et al,2016)。Tinikul 等(2009)發(fā)現(xiàn)，注射血清素可縮短羅氏沼蝦卵巢成熟和胚胎發(fā)育的時(shí)間，同時(shí)增加性腺指數(shù)和卵子卵徑。在貝類中，血清素可誘導(dǎo)貝類卵細(xì)胞成熟和排放(劉洪軍等, 1994; Hamida et al, 2004)，體外誘導(dǎo)卵子的生發(fā)泡破裂，重啟減數(shù)分裂(王琦等,2015)，使生發(fā)泡破裂的卵母細(xì)胞進(jìn)一步成熟(邸煒鵬等, 2011)。刺參和櫛孔扇貝(Chlamys farreri)的卵母細(xì)胞相似，在排出體外前處于第1 次減數(shù)分裂中期。Gianasi 等(2019)研究表明，血清素不能誘導(dǎo)冰島刺參(Cucumaria frondosa)產(chǎn)卵。本研究表明，血清素可有效促進(jìn)刺參性腺的發(fā)育。Gianasi 等(2019)研究通過向性成熟的冰島刺參注射血清素誘導(dǎo)產(chǎn)卵，本研究是通過注射血清素促進(jìn)刺參性腺發(fā)育成熟，然后通過陰干流水升溫刺激誘導(dǎo)刺參產(chǎn)卵?？梢姡逅貙Σ煌瑒?dòng)物繁殖行為的調(diào)控效果不同。

在甲殼動(dòng)物中，血清素可能通過抑制性腺抑制激素的合成和分泌，或者刺激神經(jīng)系統(tǒng)合成和分泌促性腺激素來促進(jìn)性腺發(fā)育(Wongprasert et al , 2006)。Soonthornsumrith 等(2018)認(rèn)為，羅氏沼蝦腦和卵巢中的血清素能誘導(dǎo)雌性類固醇的分泌，這些類固醇促進(jìn)卵黃發(fā)生，進(jìn)而引起卵母細(xì)胞生長和成熟。血清素在貝類中的作用是通過結(jié)合卵母細(xì)胞膜表面的G 蛋白偶聯(lián)受體，在細(xì)胞內(nèi)生成第二信使，將細(xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)細(xì)胞行為(王琦等, 2015)。Wang等(2017)從刺參呼吸樹、消化道和肌肉組織中分離出血清素受體的cDNA，啟示刺參體內(nèi)可能存在血清素結(jié)合及作用現(xiàn)象。但目前，對于血清素受體是否存在于刺參神經(jīng)系統(tǒng)或性腺中尚無相關(guān)報(bào)道。因此，后期需要對血清素促進(jìn)刺參性腺發(fā)育的機(jī)理開展進(jìn)一步研究。

本研究中，按血清素為20 μg/g 親參體重進(jìn)行注射的4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，雌參排放率和平均排卵量2 項(xiàng)指標(biāo)與對照組和空白組相比沒有顯著差異，可能是因?yàn)樽⑸鋭┝枯^小。而在剩余3 個(gè)劑量中，每20 d 注射1 次的實(shí)驗(yàn)組中，雌參排放率與對照組和空白組沒有顯著差異，說明注射間隔時(shí)間太長時(shí)，血清素不能提高刺參繁殖力。注射血清素的實(shí)驗(yàn)組刺參的卵子卵徑、受精率、受精卵孵化率、浮游幼體體長和浮游幼體附著變態(tài)率與對照組相比無顯著差異，說明注射血清素可促進(jìn)刺參性腺發(fā)育，同時(shí)對卵子質(zhì)量并無不良影響。以上結(jié)果表明，在親參培育過程中，當(dāng)培育水溫穩(wěn)定在15℃以后，按照50 μg/g 親參體重的劑量，每10 d 注射1 次血清素可顯著提高刺參排卵率和產(chǎn)卵量，且不會影響后期受精孵化過程。本研究為優(yōu)化刺參親本促熟工藝、建立刺參高效制種技術(shù)提供了科學(xué)依據(jù)。