陳吉圣 席世改 秦傳新,2① 郭 禹,2 潘莞倪 邵廣彧

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點開放實驗室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院海洋牧場技術(shù)重點實驗室 廣州 510300;2. 國家漁業(yè)資源環(huán)境大鵬觀測實驗站 深圳 518121; 3. 江蘇海洋大學(xué) 連云港 222000)

紫海膽(Anthocidaris crassi spina)是一種名貴的海珍品，在浙、閩、臺、粵、瓊等省的沿海海域均有廣泛分布，其性腺味道鮮美，且富含蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)(席世改等, 2020)，性腺提取物“波利乃寧”(Bonellinin)能抑制癌細胞的生長，可作為抗癌藥物的材料(廖承義, 1985)。近年來，隨著野生紫海膽被過度捕撈，野生資源日漸枯竭，養(yǎng)殖海膽逐漸成為海膽性腺攝取及食用的主要來源，對人工養(yǎng)殖技術(shù)需求越來越高。20 世紀以來，許多學(xué)者在紫海膽人工育苗、攝食習性及呼吸代謝等方面進行了系統(tǒng)研究(楊章武等, 2001; 馮雪等, 2012; 聶永康等,2016; 莫寶霖等, 2017; 席世改等, 2020)。

光照強度(即單位面積上所接受可見光的光通量，單位為lx)作為水生生物生長的重要環(huán)境因子，它直接或間接影響著水生生物的棲息選擇、生長發(fā)育、攝食、繁殖、晝夜活動節(jié)律等生理活動(周顯青等, 2000; 孫德文等, 2003; 王想等, 2020)。相關(guān)學(xué)者在光照強度對水生生物生長及存活、攝食等方面的影響進行了研究。薛素燕等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，強光照組刺參幼參的生長明顯快于暗光照組；郭文學(xué)等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，哲羅魚(Hucho ta imen)存活率、體長、體質(zhì)量及特定生長率參數(shù)均隨光照強度的增加而增加；光照周期對大菱鲆(Scophthatmus maximus)幼魚和尖吻鱸(Lates calcarifer)仔稚魚的攝食、消化酶活力均有顯著影響(周勝杰等, 2018; 李寶山等, 2019)；楊軍等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，光照強度影響光棘球海膽(Strongylocentrotus nudus)的聚集率，并驗證了光棘球海膽的避光特性。為提高海膽人工養(yǎng)殖技術(shù)，對不同光照條件下海膽幼體的生長特性研究至關(guān)重要。因此，本研究運用模擬自然光周期的方法，探究不同光照強度對紫海膽浮游幼體不同發(fā)育階段的生長、存活以及體內(nèi)消化酶活性的影響，不僅可以豐富棘皮動物的生理生態(tài)學(xué)理論，也可為紫海膽的人工養(yǎng)殖技術(shù)的提高提供實踐指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 浮游幼體的培育

實驗用紫海膽親體采自福建省廈門附近海域，航空運輸至中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所三亞熱帶水產(chǎn)研究院。紫海膽親體經(jīng)過陰干運輸，移入育苗水泥池中，采用流水刺激的方法，使其自然產(chǎn)卵、受精。受精卵經(jīng)38 h 發(fā)育，于兩腕浮游幼體期，用200 目和400 目(200 目過濾雜質(zhì)，400 目收集幼體)篩絹網(wǎng)濾出、清洗，再移至育苗水泥池中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為0.04 個/ml。

浮游幼體培育期間，每日換水50%，08:30 和17:30 投喂纖細角毛藻(Chaetoceros gracilis)和叉鞭金藻(Dicrateria zhanjiangensis)的等比例混合藻液。每次投喂1×104～7×104個/ml 混合藻液2 L。浮游幼體培育期間水體體積為450 L，水溫(29.5±0.5)℃、pH 8.0±0.1、鹽度31.4±0.9。藻類均取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所三亞熱帶水產(chǎn)研究院藻種室，采用f/2 培養(yǎng)液自然光照培養(yǎng)。實驗全程保持每個實驗桶的水溫、pH 和鹽度的相對恒定。

1.2 實驗方法

實驗設(shè)置的光照強度為0(全黑暗)、500、1000、2000 和3000 lx，每個梯度設(shè)3 個重復(fù)，測定光照強度對紫海膽浮游幼體體長生長和消化酶活性的影響。養(yǎng)殖容器為760 L 的PVC 水桶。實驗中每組的光照強度通過更換每個水桶上方的燈泡功率及調(diào)整光源距離來實現(xiàn)，并用照度計(Lx meter AR813A)于水面上方3 cm 處測定光照強度。為避免自然光與實驗組光源的干擾，每個水桶上方均覆蓋黑色遮光布，期間采用12 L : 12 D(08:00～20:00)光照周期，全黑暗處理每天總計約有30 min 暴露在光照下進行投喂、換水、吸底等日常操作。

實驗自紫海膽兩腕浮游幼體期即2 日齡開始，至18 日齡變態(tài)期結(jié)束。根據(jù)其發(fā)育階段分別于實驗的8 d(四腕幼體)、11 d(六腕幼體)、16 d(八腕幼體)取樣(混勻培育水體，隨機多點取樣)并保存于-80℃冰箱。

光照強度對紫海膽浮游幼體體長的影響實驗使用Toup View 圖像分析軟件進行拍照并測量大小，具體為各實驗組紫海膽浮游幼體樣品的體長、軀干部骨針長度和口后腕骨針長度。

光照強度對紫海膽浮游消化酶活性的影響實驗采用可見分光光度法，用酶標儀(WD-2012B，北京六一生物科技有限公司)測量各樣品消化酶的活性。淀粉酶活性采用北京雷根生物淀粉酶(Amylase)檢測試劑盒，胃蛋白酶活性采用北京索萊寶胃蛋白酶(Pepsin)試劑盒，脂肪酶活性用索橋生物脂肪酶(Lipase)測試盒，具體步驟均按試劑盒說明書進行操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用Excel 2010 和SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，所有數(shù)值均采用平均值±標準差(Mean±SD)表示，進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05 為差異顯著。采用Origin 8.1 繪制紫海膽浮游幼體體長變化和消化酶活性變化圖。

2 結(jié)果

2.1 不同光照強度下浮游幼體的生長率

紫海膽浮游幼體的生長數(shù)據(jù)見圖1，光照強度對紫海膽浮游幼體的體長、軀干部骨針長度和口后腕骨針長度的影響表現(xiàn)一致。趨勢由高到低為500 lx＞全黑暗＞1000 lx＞2000 lx＞3000 lx。在500 lx 條件下，紫海膽浮游幼體的體長、軀干部骨針長度和口后腕骨針長度都達到最高，生長最快且顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。而在3000 lx 條件下，紫海膽浮游幼體發(fā)育到11 d 于四腕幼體期停止生長，全部死亡。

2.2 不同光照強度下浮游幼體的消化酶活性

紫海膽浮游幼體的脂肪酶活性見圖2，紫海膽四腕幼體階段的脂肪酶活性隨著光照強度的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。在光照強度為1000 lx 時，脂肪酶活性最低。光照強度500 lx 時，脂肪酶活性最強，但與其他實驗組差異不顯著(P＞0.05)。紫海膽六腕幼體階段的脂肪酶活性活性差別較小，光照強度為1000 lx 時，脂肪酶活性最低，與其他實驗組差異顯著(P＜0.05)。紫海膽八腕幼體階段的脂肪酶活性隨光照強度增加呈先上升后下降的趨勢。光照強度500 lx時，脂肪酶活性最強，與其他實驗組相比差異顯著(P＜0.05)。

圖1 不同光照強度下浮游幼體體長(a)、軀干部骨針長度(b)和口后腕骨針長度(c)Fig.1 Effects of light intensity on larval length (a), body-rod length (b), and post-oral arm length (c) of sea urchin larvae

圖2 光照強度對紫海膽浮游幼體脂肪酶活性的影響Fig.2 Effects of light intensity on lipase activity of sea urchin larvae

紫海膽浮游幼體的淀粉酶活性見圖3，該階段淀粉酶活性隨光照強度的增加呈先上升后下降的趨勢。在光照強度為500 lx 時，淀粉酶活性最強，與其他實驗組差異顯著(P＜0.05)。光照強度為3000 lx 時，淀粉酶活性最低，與其他實驗組相比差異顯著(P＜0.05)。

紫海膽浮游幼體的胃蛋白酶活性如圖4 所示。紫海膽六腕階段光照強度對胃蛋白酶活性的影響較大，隨著光照強度的增強呈先下降后上升的趨勢。在光照強度為2000 lx 時，紫海膽六腕階段的胃蛋白酶活性最強，與其他實驗組之間差異顯著(P＜0.05)。在光照強度為3000 lx 時，胃蛋白酶活性最低，與其他實驗組之間差異顯著(P＜0.05)。

圖3 光照強度對紫海膽浮游幼體淀粉酶活性的影響Fig.3 Effects of light intensity on amylase activity of sea urchin larvae

圖4 光照強度對紫海膽浮游幼體胃蛋白酶活性的影響Fig.4 Effects of light intensity on pepsin activity of sea urchin larvae

3 討論

3.1 光照強度對紫海膽浮游幼體存活的影響

光照強度對水生生物生長的影響因種類不同而存在顯著差異。瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachell i)適合在光照強度為0～10 lx 的環(huán)境下生活(白艷勤等, 2014)。九孔鮑(Haliotis d iversicolor aquatilis)幼鮑最適宜的光照強度為700～1000 lx (嚴正凜等, 2001)。大鱗大麻哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)的生長速度在強光下高于在弱光下。北極紅點鮭(Salvelinus alpinus)幼體生長速度在 50 lx 的光照強度下最快，死亡率最低(Minagawa, 1994)。刺參(Apostichopus japonicus)幼體生長速度隨著光照強度的增加而減慢，在光照強度為50 lx 的光照環(huán)境下，生長速度最快(張鵬等, 2013)。參考光照強度對刺參行為特性的影響(張碩等, 2006)及海參大多選擇光強強度較低的區(qū)域棲息(常亞青等,2004)等信息，紫海膽浮游幼體通過調(diào)整晝夜活動節(jié)律來尋找較弱光照強度更適合其生長發(fā)育。經(jīng)此次實驗發(fā)現(xiàn)，光照強度對紫海膽浮游幼體的生長發(fā)育影響顯著，在500 lx 光照環(huán)境下生長最快且存活率最高，全黑暗次之；在3000 lx 下生長最慢且存活率最低，在發(fā)育至11 d 時全部死亡。光照可直接或間接影響同為棘皮動物刺參幼參的攝食等生理活動(魏子仲等,2014)，分析認為，3000 lx 光照強度代表自然生長環(huán)境中陽光輻射過強或過于靠近水體表層，超過了紫海膽浮游幼體承受的臨界值，使其攝食效率下降，不能積蓄充足能量繼續(xù)生長發(fā)育，最終死亡，導(dǎo)致存活率下降，而光照強度對紫海膽浮游幼體攝食效率的影響也有待繼續(xù)探究。

3.2 光照強度對紫海膽浮游幼體消化酶活性的影響

消化酶的主要功能是消化和分解生物從外界攝取的食物，為個體提供生長發(fā)育、繁殖和晝夜活動等所需的能量，其活力的大小能夠反映水產(chǎn)生物消化生理的基本特征，環(huán)境因子的變化會導(dǎo)致身體失去更多的能量，這在一定程度上就需要消化酶更活躍地消化食物，以保證能量的正常供應(yīng)(任曉偉, 2008)。目前，主要的研究方向為飼料脂肪水平、不同蛋白源、環(huán)境因子(溫度、pH 等)對消化酶的影響(李俊輝等, 2011;侯受權(quán)等, 2016; 左然濤等, 2017)。

光照是水生生物生長的重要的環(huán)境因子，光照強度對水生生物生理活動的影響體現(xiàn)在多方面(周顯青等, 2000)。王芳等(2006)研究發(fā)現(xiàn)，完全黑暗下，中國對蝦(Fenneropenaeus ch inensis)稚蝦的蛋白酶活力最強。魏子仲等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，在2000 lx 光照強度下，刺參幼參的消化酶和脂肪酶活性最強；1000 lx光照強度下蛋白酶活性最強。本研究結(jié)果表明，在光照強度為500 lx 時，紫海膽浮游幼體的脂肪酶和淀粉酶活性最強，在光照強度為2000 lx 時，胃蛋白酶活性最強，可見不同消化酶對光照強度的響應(yīng)存在差異，且光照強度的增加在一定程度上促進了消化酶活性。光照強度的變化改變了紫海膽浮游幼體的3 種消化酶活性，并最終導(dǎo)致其存活率的改變。

3.3 光照強度對紫海膽浮游幼體不同階段的消化酶活性的影響

研究表明，生物在不同生長發(fā)育階段的消化酶活性也有所不同。隨著大黃魚(Pseudosciaena crocea)的發(fā)育，其體內(nèi)的蛋白酶活性呈逐漸降低趨勢，而脂肪酶和淀粉酶活力呈上升趨勢(席峰等, 2003)。隨著牙鲆(Paralichthys olivaceus)的發(fā)育，其體內(nèi)的蛋白酶、脂肪酶活性逐漸增強，而淀粉酶活性呈下降趨勢(王宏田等, 2002)。隨著刺參從幼體發(fā)育到稚參，體內(nèi)的蛋白酶和淀粉酶活力呈上升趨勢，而褐藻酸酶的活性呈下降趨勢(唐黎等, 2007)。本研究中，紫海膽不同發(fā)育階段幼體的各種消化酶活性也有所不同，通過對比發(fā)現(xiàn)，脂肪酶和淀粉酶活性在八腕幼體階段有所下降，而胃蛋白酶活性有所上升，分析認為，與其生活方式轉(zhuǎn)變和食性變化有關(guān)，這期間由浮游生活轉(zhuǎn)變?yōu)榈讞街?，食性也由浮游生物逐漸過渡到底棲硅藻及有機碎屑，食譜中逐漸出現(xiàn)動物性蛋白，由此表現(xiàn)在其消化酶中胃蛋白酶的活性逐漸優(yōu)于其他2種消化酶。

4 結(jié)論

本研究表明，紫海膽浮游幼體在弱光環(huán)境的生長發(fā)育過程明顯優(yōu)于強光環(huán)境，光照強度為500 lx 時，生長率最佳且能保持良好存活率；光照強度為3000 lx時生長最慢且死亡率最高。特定光照強度對紫海膽浮游幼體不同消化酶的影響不同，光照強度為500 lx時，脂肪酶、淀粉酶活性最強；光照強度為2000 lx時，胃蛋白酶活性最強；光照強度為1000 lx 時，脂肪酶活性最低；光照強度為3000 lx 時，淀粉酶、胃蛋白酶活性最低。綜上可知，高光照強度降低了紫海膽浮游幼體的生長率、存活率及消化酶的活性，是紫海膽浮游幼體生長發(fā)育的不利因素。在本實驗條件下，500 lx 的光照強度下，紫海膽浮游幼體有最高生長率且存活率良好，總消化酶活性最強且各消化酶活性最均衡，是其生長發(fā)育的最佳光照強度，結(jié)合紫海膽浮游幼體的發(fā)育階段，在日常生產(chǎn)管理中，或可通過控制光照強度來提高紫海膽的生長發(fā)育效果。目前，光照強度對紫海膽幼體生長發(fā)育影響的相關(guān)內(nèi)容尚不完善，未來可細化弱光照強度梯度探討最適宜其生長的弱光環(huán)境，對此方面的研究內(nèi)容做出補充，既能豐富該方面的生理生態(tài)學(xué)知識，也能繼續(xù)為紫海膽的人工增養(yǎng)殖提供科學(xué)指導(dǎo)和依據(jù)。