榮小軍 李 彬 廖梅杰① 王印庚 王治平王錦錦 于永翔 張 正 范瑞用

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 青島瑞滋集團(tuán)有限公司 青島 266408)

刺參(Apostichopus j aponicus)自然分布于太平洋西部的中國(guó)、俄羅斯、韓國(guó)與日本沿海(廖玉麟, 1997)。20 世紀(jì)80 年代，刺參人工育苗技術(shù)突破后，刺參養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，目前已成為引領(lǐng)我國(guó)第五次海水養(yǎng)殖浪潮的主要品種。然而，近年來(lái)隨著產(chǎn)業(yè)規(guī)模的急劇擴(kuò)大，養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)的種質(zhì)退化、疾病頻發(fā)、產(chǎn)品質(zhì)量安全等問(wèn)題日益突出，對(duì)刺參養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成巨大威脅(王印庚等, 2014)。刺參良種選育和規(guī)?；茝V是解決上述問(wèn)題的重要手段之一。中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所采用群體選育方法，以抗病力和生長(zhǎng)速度為選育目標(biāo)，經(jīng)過(guò)累代選育，培育出生長(zhǎng)速度快、抗病力強(qiáng)、成活率高的刺參“參優(yōu)1 號(hào)”新品種(GS-01-016-2017)，為刺參養(yǎng)殖種質(zhì)提升提供了種質(zhì)基礎(chǔ)。然而，生物的性狀表現(xiàn)是環(huán)境和基因共同作用的結(jié)果，我國(guó)海參養(yǎng)殖區(qū)域跨度大、養(yǎng)殖模式多樣、水域環(huán)境復(fù)雜，要充分發(fā)揮良種的種質(zhì)潛力，需要對(duì)其生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，相應(yīng)結(jié)果也將有助于良種最適養(yǎng)殖區(qū)和養(yǎng)殖模式的確定，進(jìn)而為獲得最佳的良種增產(chǎn)貢獻(xiàn)率提供科學(xué)指導(dǎo)。

pH 是水體環(huán)境的關(guān)鍵指標(biāo)，研究表明，pH 的升高或降低會(huì)對(duì)魚、蝦、貝、參等水生動(dòng)物的存活、生長(zhǎng)和免疫酶活性產(chǎn)生直接影響(王雙耀等, 2013; 王蕓等, 2013; 文春根等, 2009; 韓莎等, 2018a)。在池塘養(yǎng)殖過(guò)程中，因天氣、浮游藻類繁殖、池底大型藻類生長(zhǎng)、底質(zhì)老化、人工投餌或微生態(tài)制劑使用等因素的影響，養(yǎng)殖水體的pH 值常會(huì)發(fā)生波動(dòng)或劇烈變化，監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，池塘養(yǎng)殖水體的pH 值在4.0～10.0 范圍內(nèi)大幅度波動(dòng)(韓莎等, 2018b)。近年來(lái)，在外海海域，受海洋酸化、赤潮、綠潮等影響，外海的pH 值也會(huì)發(fā)生大幅波動(dòng)。隨著刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，尤其是“東參西養(yǎng)”和“北參南養(yǎng)”模式的快速發(fā)展，刺參養(yǎng)殖區(qū)從最初的自然分布區(qū)逐步拓展到黃河三角洲地區(qū)和閩浙沿海，刺參的養(yǎng)殖模式涉及外海底播增殖、灘涂的圍堰養(yǎng)殖、池塘養(yǎng)殖以及陸基的工廠化養(yǎng)殖等多種模式，養(yǎng)殖用水的pH 受相應(yīng)因素的影響波動(dòng)較大，pH 值變化會(huì)對(duì)良種的生理、生長(zhǎng)及優(yōu)良性狀的表現(xiàn)產(chǎn)生影響。本研究測(cè)定了不同pH 條件下刺參“參優(yōu)1 號(hào)”的生長(zhǎng)、存活、呼吸代謝以及非特異性免疫酶活性變化，旨在探明“參優(yōu)1 號(hào)”對(duì)pH 的適應(yīng)性，分析不同pH 條件下“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的生長(zhǎng)、呼吸代謝和免疫等特征變化，進(jìn)而確定其最適pH 條件及其耐受機(jī)制，為該良種的推廣提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用刺參苗種為2019 年中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所在青島瑞滋集團(tuán)有限公司培育的“參優(yōu)1 號(hào)”苗種，平均規(guī)格為(5.00±0.75) g/頭。選取活力良好的個(gè)體，在水槽中暫養(yǎng)7 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)刺參對(duì)pH 的耐受特點(diǎn)和各養(yǎng)殖模式下海水的pH 變化范圍，本研究設(shè)8 個(gè)pH 梯度：6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 和10.0。實(shí)驗(yàn)所用海水以砂濾潔凈海水為基礎(chǔ)，利用NaOH 或HCl 調(diào)節(jié)至相應(yīng)pH，采用pH 測(cè)定儀測(cè)定相應(yīng)pH，配制好的海水分別儲(chǔ)備在單獨(dú)的1 m3的聚丙烯水槽中。各pH 實(shí)驗(yàn)組所用養(yǎng)殖水槽為塑料水槽，水槽容積為30 L。以自然海水pH 值為基礎(chǔ)，按照每天降低或升高0.5 個(gè)pH對(duì)實(shí)驗(yàn)用海水進(jìn)行酸堿度的梯度降低或升高。每個(gè)pH 實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)平行，每個(gè)平行放置30 頭刺參，其中3 個(gè)平行用于測(cè)定相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件下苗種的生長(zhǎng)和存活，另外1 個(gè)平行用于呼吸代謝和酶活性測(cè)定樣品的獲取。實(shí)驗(yàn)期間的養(yǎng)殖管理：每天投喂配合飼料1 次，按照刺參體重的2%投喂，每天定時(shí)吸底、清污并補(bǔ)充相同pH 的儲(chǔ)存海水，換水量為50%。實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄各實(shí)驗(yàn)組刺參的攝食、運(yùn)動(dòng)狀況，及時(shí)挑出化皮死亡個(gè)體并繪制存活率曲線。根據(jù)實(shí)驗(yàn)前后刺參存活的個(gè)體數(shù)和平均體重計(jì)算各組存活率(Survival rate, SR)和特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate, SGR)，設(shè)置相同的實(shí)驗(yàn)條件，在第7 天測(cè)定各組刺參的呼吸代謝，在0、10、20 和30 d 自各實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)抽取刺參苗種，測(cè)定其非特異性免疫酶活性。

1.2.1 不同pH 條件下刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的特定生長(zhǎng)率和存活率 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，測(cè)定并計(jì)算苗種的初始平均體重。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天觀察并記錄苗種的存活數(shù)量，繪制存活率曲線圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)定并計(jì)算終末平均體重，采用以下公式計(jì)算苗種的存活率和特定生長(zhǎng)率：

存活率(SR)=Nt/N0×100%

特定生長(zhǎng)率(SGR)=(lnWt-lnW0)×100/t

式中，N0和Nt分別為刺參初始苗種數(shù)量和終末存活苗種數(shù)量，W0和Wt分別為刺參苗種的初始平均體重和苗種的終末平均體重(g)，t 為養(yǎng)殖天數(shù)。

1.2.2 不同pH 條件下刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的呼吸代謝 各組到達(dá)設(shè)定的pH 條件的第7 天測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組刺參的呼吸代謝，實(shí)驗(yàn)在2 L 呼吸瓶中進(jìn)行，每個(gè)測(cè)試瓶中加入相應(yīng)pH 的海水和刺參，每個(gè)pH 梯度設(shè)3 個(gè)平行組，每組10 頭刺參，同時(shí)設(shè)置3 個(gè)不添加刺參苗種的呼吸瓶作為空白對(duì)照組。所有呼吸瓶放入同一個(gè)溫度為16℃的水槽中以保持相同的溫度環(huán)境條件(章龍珍等, 2009)。每個(gè)呼吸瓶放入刺參苗種并加滿相應(yīng)pH 的儲(chǔ)存海水后，立即用橡皮塞封口，封口4 h 后用虹吸法收集各呼吸瓶中的水樣，用碘量法(GB17378.4-2007)和次溴酸鈉氧化法(GB17378.4-2007)測(cè)定各樣品中的溶解氧(DO)和氨氮(NH3-N)濃度，根據(jù)如下公式計(jì)算相應(yīng)pH 條件下刺參的耗氧率(RO)和排氨率(RN)，并進(jìn)一步測(cè)算其氧氮比(O/N)。

耗氧率(RO)=[(O0-Ot)V]/(W×t)

排氨率(RN)=[(Nt-N0)V]/(W×t)

氧氮比(O/N)=(RO/16)/(RN/14)

式中，Ot和O0為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組水體的溶解氧濃度(mg/L)，Nt和N0分別為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組水體的氨氮濃度(mg/L)，t 為實(shí)驗(yàn)周期(h)；W 為參與測(cè)試的刺參苗種的體重(g)，V 為實(shí)驗(yàn)的水體體積(L)。

1.2.3 不同pH 條件下刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的非特異性免疫酶活性變化 本研究實(shí)驗(yàn)周期為30 d，分別在0 d、10 d、20 d、30 d 自各pH 組中隨機(jī)抽取3 頭刺參苗種，解剖吸取體腔液，4℃條件下，3000 g離心10 min，吸取上清液，進(jìn)行酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性測(cè)定，酶指標(biāo)測(cè)定選用南京建成生物公司的試劑盒。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行圖表繪制，用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重分析采用Turkey 檢驗(yàn)，按照P＜0.05 對(duì)不同pH組相應(yīng)測(cè)定指標(biāo)的差異進(jìn)行顯著性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種存活的影響

實(shí)驗(yàn)期間，不同pH 條件下刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1。由圖1 可以看出，pH值對(duì)苗種存活影響很大，在pH 6.5～9.5 條件下，苗種30 d 存活率均為100%，且苗種攝食、運(yùn)動(dòng)正常，附著力較強(qiáng)，而pH 10.0 實(shí)驗(yàn)組，苗種活力下降，附著力降低，逐漸沉到水槽底部，攝食減少，部分個(gè)體出現(xiàn)化皮和死亡現(xiàn)象，到第4 天苗種全部死亡，死亡率達(dá)100%。

2.2 pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種生長(zhǎng)的影響

由于pH 10.0 條件下測(cè)試苗種全部死亡，無(wú)法計(jì)算實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)苗種的SGR，對(duì)pH 6.5～9.5 各實(shí)驗(yàn)組苗種的SGR 計(jì)算結(jié)果見圖2。由圖2 可以看出，在pH 6.5～9.5 之間，苗種的SGR 隨pH 升高呈先升高后降低的趨勢(shì)。在pH 6.5～7.0 之間，苗種的SGR 為負(fù)值；在pH 7.5～8.5 之間，SGR 為正值，在pH 9.0～9.5范圍內(nèi)SGR 降為負(fù)值。在pH 6.5～ 8.0 之間，苗種的SGR 顯著升高(P＜0.05)，在pH 8.0～9.5 之間，SGR 逐漸降低。其中，在pH 8.0 實(shí)驗(yàn)組SGR 最高，最高值為0.541%/d。

圖1 不同pH 條件對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的存活影響Fig.1 Effect of pH on survival rate of sea cucumber “Shenyou No.1”

圖2 不同pH 條件下刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的特定生長(zhǎng)率Fig.2 Specific growth rate of sea cucumber“Shenyou No.1”under different pH

依據(jù)所測(cè)得的不同pH 條件下的苗種的SGR 數(shù)據(jù)并通過(guò)excel 數(shù)據(jù)趨勢(shì)，推導(dǎo)不同pH 條件下生長(zhǎng)率曲線公式，在pH 6.5～9.5 范圍內(nèi)，pH 和苗種SGR 的關(guān)系可以用以下公式表示：SGR=-0.6298p2+10.132p-40.195 (R2=0.9892)。據(jù)公式推算出刺參“參優(yōu)1 號(hào)”在pH 條件為8.04 時(shí)，將獲得最大的SGR。

2.3 pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種呼吸代謝的影響

不同pH 條件下刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的RO的測(cè)定結(jié)果見圖3。由圖3 可知，在pH 6.5～9.5 范圍內(nèi)，隨pH 的升高RO呈“V”型變化趨勢(shì)，在pH 6.5～8.0范圍內(nèi)，隨著pH 的上升RO逐漸降低，并在pH 8.0時(shí)達(dá)最低[19.07 μg/(g·h)]；在pH 8.0～9.5 范圍內(nèi)，隨pH 的升高RO逐漸升高。RO在pH 6.5 和pH 9.5 組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，均處于較高水平。

圖3 不同pH 條件下刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的耗氧率Fig.3 Oxygen consumption rate of sea cucumber“Shenyou No.1” under different pH

不同pH 條件下刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的RN的測(cè)定結(jié)果見圖4。從圖4 可知，不同pH 條件下苗種RO變化趨勢(shì)相似，在pH 6.5～9.5 范圍內(nèi)隨著pH 升高，實(shí)驗(yàn)苗種的RN呈“V”型變化趨勢(shì)，并在pH 8.0 時(shí)實(shí)驗(yàn)組達(dá)到最低谷，最低值為1.34 μg/(g·h)；并且苗種RN在pH 7.5 和pH 8.5 之間以及pH 6.5 和pH 9.5 組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

圖4 不同pH 條件下刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的排氨率Fig.4 Ammonia excretion rate of sea cucumber“Shenyou No.1” under different pH

根據(jù)RN和RO計(jì)算不同pH 條件下刺參苗種的O/N 結(jié)果見表1。從表1 可以看出，不同的pH 組O/N的值均在11 左右，在pH 8.0 組苗種的O/N 比最高，為12.40±1.17，但不同pH 條件下各實(shí)驗(yàn)組苗種的O/N無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.4 pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種非特異性免疫酶活力的影響

由于在pH 10.0 組實(shí)驗(yàn)過(guò)程中測(cè)試用苗種全部死亡，未對(duì)該實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行體腔液獲取和酶指標(biāo)的測(cè)定。本研究對(duì)pH 6.5～9.5 條件下苗種的非特異性免疫酶活性(包括ACP、AKP、LZM 和SOD)的測(cè)定結(jié)果見圖5～圖8。

表1 pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”O(jiān)/N 的影響Tab.1 Effect of pH on O/N of sea cucumber “Shenyou No.1”

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組ACP 酶活力的測(cè)定結(jié)果見圖5，pH為8.0 的實(shí)驗(yàn)組，在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)的各時(shí)間點(diǎn)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的ACP 活性無(wú)顯著變化(P＞0.05)，其余實(shí)驗(yàn)組ACP 活性隨養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)呈波動(dòng)起伏趨勢(shì)。對(duì)比相同時(shí)間節(jié)點(diǎn)不同pH 條件實(shí)驗(yàn)組的酶活力結(jié)果可以看出，隨著pH 的升高ACP 活性呈“V”型波動(dòng)趨勢(shì)，且在pH 8.0 時(shí)達(dá)到最低值。

圖5 pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”體腔液ACP 活性的影響Fig.5 Effect of pH on ACP activity of coelomic fluid in sea cucumber “Shenyou No.1”

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組苗種AKP 酶活力的測(cè)定結(jié)果見圖6，在pH 6.5～9.5 范圍內(nèi)，AKP 的活性受pH 影響變化顯著，在pH 6.5～8.0 范圍內(nèi)，AKP 的活性隨pH 升高而逐漸降低，并在pH 為8.0 時(shí)達(dá)到最低值，且pH 8.0實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的AKP 活力沒(méi)有顯著變化(P＞0.05)；在pH 8.0～9.5 范圍內(nèi)，AKP的活性隨pH 升高而逐漸升高。

不同pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”體腔液中LZM 活性的影響見圖7。從圖7 可以看出，在pH 6.5～8.0 范圍內(nèi)，LZM 的活性隨pH 升高而逐漸降低，并在pH為8.0 時(shí)達(dá)到最低值，且pH 8.0 實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的LZM 活力沒(méi)有顯著變化(P＞0.05)，pH 8.0～9.5 范圍內(nèi)，LZM 的活性隨pH 升高而逐漸升高；除pH 8.0 組外，其他實(shí)驗(yàn)組LZM 的活性隨時(shí)間均呈先升高再降低的趨勢(shì)，并在第10 天到達(dá)到峰值。

圖6 pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”體腔液AKP 活性的影響Fig.6 Effect of pH on AKP activity of coelomic fluid in sea cucumber “Shenyou No.1”

圖7 pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”體腔液LZM 活性的影響Fig.7 Effect of pH on LZM activity of coelomic fluid in sea cucumber “Shenyou No.1”

圖8 pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”體腔液SOD 活性的影響Fig.8 Effect of pH on SOD activity of coelomic fluid in sea cucumber “Shenyou No.1”

不同pH 對(duì)刺參“參優(yōu)1 號(hào)”體腔液中SOD 活性的影響見圖8。從圖8 可以看出，在pH 6.5～9.5 范圍內(nèi)，0 d 和10 d 時(shí)SOD 活性隨pH 的升高呈“V” 型變化趨勢(shì)，最低值在pH 8.0；20 d 和30 d 時(shí)pH 的變化對(duì)SOD 的活性影響相對(duì)較??；pH 8.0 實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)，刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的SOD 活力變化不顯著(P＞0.05)；此外，各實(shí)驗(yàn)組SOD活性均在0 d 時(shí)最高，在第10 天時(shí)活性呈降低趨勢(shì)，在20 d 和30 d 時(shí)活性較低。

3 討論

3.1 刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種在不同pH 條件下的適應(yīng)性

水體pH 值是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的一個(gè)重要的環(huán)境因子，pH 的高低直接影響水生動(dòng)物的生長(zhǎng)及生理代謝(曹善茂等, 2015; Hu et al, 2015)。刺參在pH 不適時(shí)會(huì)出現(xiàn)棘刺收縮、身體卷曲、糞便變細(xì)變短、池底的殘餌量增加等現(xiàn)象。在刺參養(yǎng)殖過(guò)程中，水體中的pH 會(huì)因養(yǎng)殖管理、酸雨和水體污染等因素的影響而產(chǎn)生波動(dòng)，而且不同池塘pH 也存在差異，對(duì)水產(chǎn)新品種而言，選育目標(biāo)性狀決定了其在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用潛力，而新品種生態(tài)適應(yīng)性則決定了其推廣范圍和區(qū)域。刺參“參優(yōu)1 號(hào)”是以抗?fàn)N爛弧菌(Vibrio splendidus)能力和生長(zhǎng)速度為選育目標(biāo)培育出的刺參新品種，為獲得最大的良種貢獻(xiàn)率，需要對(duì)該品種的酸堿度適應(yīng)范圍進(jìn)行評(píng)估，以期根據(jù)不同區(qū)域養(yǎng)殖水域pH 范圍進(jìn)行合理推廣，從而發(fā)揮良種的最大貢獻(xiàn)率。

水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)pH 的適應(yīng)范圍存在物種的差異。相關(guān)研究表明，黃顙魚(Pseudobagrus f uvlidraco)在pH 7.0～8.0 范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好(崔平等, 2018)，縊蟶(Sinonovacula constricta)在pH 7.5～9.5 可正常存活(葉博等, 2019)，中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)在幼蟹時(shí)期適宜的pH 范圍為8.0～9.0 (劉金生等, 2016)。在本研究中，pH 10.0 實(shí)驗(yàn)組第4 天苗種全部死亡，是由于水體堿性過(guò)高，刺參出現(xiàn)急性中毒現(xiàn)象；在pH 7.5～8.5之間苗種呈正生長(zhǎng)，超出或低于此范圍，苗種呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。研究表明，pH 值過(guò)高或過(guò)低導(dǎo)致海洋生物生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，是因?yàn)樗釅A度的變化導(dǎo)致生物體內(nèi)滲透壓發(fā)生改變，為了維持體內(nèi)的酸堿平衡，必然會(huì)轉(zhuǎn)移部分用于其他生理過(guò)程的能量進(jìn)行反饋補(bǔ)償性代謝，從而影響了生物其他的正常生理活動(dòng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育變慢(湛垚垚等, 2013)。劉洋等(2020)研究發(fā)現(xiàn)，海灣扇貝(Argopecten irradia)幼蟲在pH 低于7.6 的條件下出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象。Asha 等(2005)研究發(fā)現(xiàn)，尖塔海參(Holothuria sp inifera)幼蟲的最適生存pH 為7.8，在pH 達(dá)到9.0 的時(shí)候?qū)嶒?yàn)個(gè)體已全部死亡。本研究緩慢調(diào)節(jié)pH 后30 d 的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺參“參優(yōu)1 號(hào)”的存活pH 為6.5～9.5，最適生長(zhǎng)pH 為7.5～8.5。韓莎等(2018b)研究表明，青島國(guó)家海洋科研中心選育的刺參苗種適宜生長(zhǎng)的pH 范圍為7.6～8.8，與本研究結(jié)果相近。Luo 等(2019)調(diào)研了大連刺參養(yǎng)殖池塘的pH 年變化范圍為7.86～8.38，表明該地酸堿度符合“參優(yōu)1 號(hào)”苗種的pH 適應(yīng)性，有利于良種優(yōu)勢(shì)性狀的發(fā)揮。

3.2 刺參“參優(yōu)1 號(hào)”在不同pH 條件下的呼吸代謝特征

pH 波動(dòng)會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生一定的刺激，從而導(dǎo)致呼吸代謝變化(Stumpp et al, 2011、2012)。曹善茂等(2015)研究表明，中華原鉤蝦(Eogammarus sinensis)在最適pH 范圍內(nèi)的RO和RN均處在較高水平，Savant等(1995)的研究也呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。而朱愛(ài)意等(2007)研究顯示，褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)在最適pH范圍內(nèi)的RO和RN相對(duì)較低，在pH 不適時(shí)RO和RN會(huì)提高。本研究結(jié)果顯示，pH 8.0 實(shí)驗(yàn)組刺參的RO和RN最低，pH 偏移會(huì)使RO和RN上升，是由于在適宜的pH 下，機(jī)體的基礎(chǔ)代謝較低，耗能較少；在pH脅迫下，機(jī)體需要消耗更多的能量去維持體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境平衡，此趨勢(shì)與章龍珍等(2009)對(duì)長(zhǎng)鰭籃子魚(Siganus canaliculatus)幼魚的研究結(jié)果類似。

氧氮比(O/N)是反映生物對(duì)環(huán)境適應(yīng)情況和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供能情況的指標(biāo)(Ikeda, 1974)，不同的生物之間O/N 受pH 影響的變化趨勢(shì)存在差異。O/N 表示生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物分解代謝之間的關(guān)系(曹善茂等, 2015)。Mayzalld(1976)提出，O/N 約為7時(shí)，生物體能量完全由蛋白質(zhì)氧化提供；Ikeda (1974)認(rèn)為，O/N 約為24 時(shí)，生物體所需能量由蛋白質(zhì)和脂肪氧化提供；如果主要由脂肪或碳水化合物提供，O/N 將變?yōu)闊o(wú)窮大(Conover et al, 1968)。相關(guān)研究表明，中華小長(zhǎng)臂蝦(Palaemonetes sinensis)在pH 4.0～9.0之間O/N 呈波動(dòng)趨勢(shì)，pH 的升高會(huì)使長(zhǎng)肋日月貝(Amusium pleuronectes)的O/N 升高，在pH 7.7 和pH 8.7的水體中文蛤(Meretrix meretrix)O/N 顯著高于pH 6.7和pH 9.7(姜宏波等, 2017; 嚴(yán)俊賢等, 2018; 楊杰青等, 2016)。本研究表明，pH 的變化對(duì)刺參O/N 無(wú)顯著影響，說(shuō)明pH 的變化不會(huì)改變刺參代謝底物，與上述研究結(jié)果不同的原因可能由于物種差異所致。

3.3 刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種在不同pH 條件下的免疫酶活性特征

水體中pH 過(guò)高或者過(guò)低會(huì)影響刺參體腔液的酸堿度，直接影響其各種生理過(guò)程。另外，pH 變化還會(huì)導(dǎo)致有益微生物的大量死亡，病原菌及有害生物的大量繁殖打破了水體中的生態(tài)平衡，進(jìn)而間接影響到刺參機(jī)體的代謝和免疫過(guò)程。研究表明，pH 脅迫會(huì)影響水產(chǎn)動(dòng)物免疫酶的活性(魏煒等, 2001; 王維娜等,2002)，因此，可以通過(guò)檢測(cè)刺參體內(nèi)主要免疫酶的活性來(lái)反映對(duì)pH 的適應(yīng)情況。ACP 和AKP 是動(dòng)物體內(nèi)參與免疫防御等活動(dòng)的2 種重要的水解酶, 是溶酶體酶的重要標(biāo)志酶(文春根等, 2009)。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的抗應(yīng)激酶，它可以將機(jī)體內(nèi)過(guò)多的O2-催化生成H2O2和O2，從而起到保護(hù)機(jī)體的作用(Sui et al, 2016)。本研究結(jié)果表明，pH 變化顯著影響了刺參“參優(yōu)1 號(hào)”的ACP、AKP、LZM和SOD 活性。從相同pH 條件下30 d 實(shí)驗(yàn)期內(nèi)酶指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果可以看出，LZM 活性在第10 天最高，SOD 活性在第0 天最高，而后開始降低，ACP 和AKP則隨時(shí)間延長(zhǎng)呈波動(dòng)變化，表明刺參體腔細(xì)胞在應(yīng)對(duì)pH 變化過(guò)程中，不同酶指標(biāo)的變化響應(yīng)時(shí)間存在差異性。Gullian 等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，墨西哥海參體內(nèi)的SOD 在pH 7.7 的時(shí)候活性較高。Zhao 等(2010)通過(guò)添加酵母多糖進(jìn)行pH 脅迫(pH 為5.5 和10.0) 24 h 后，使LSZ 和ACP 活性升高，但其僅代表24 h 的數(shù)據(jù)，并未驗(yàn)證該pH 條件下海參能否長(zhǎng)期存活。趙先銀等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦的多種酶活性對(duì)不同pH 條件的響應(yīng)時(shí)間也存在差異。從不同的pH 組之間酶指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果可以看出，4 種免疫酶的活性均在最適生長(zhǎng)的pH 8.0 實(shí)驗(yàn)組最低，隨著pH 的偏移，4 種免疫酶活性均出現(xiàn)升高趨勢(shì)，變化趨勢(shì)與付監(jiān)貴等(2016)對(duì)日本沼蝦(Macrobrachium n ipponense)的研究結(jié)果類似；樊甄姣等(2006)對(duì)櫛孔扇貝(Chlamys farreri)的研究也發(fā)現(xiàn)，在pH 7.0～9.0 之間，實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)出隨pH偏移，各種酶活性升高的現(xiàn)象；文春根等(2009)研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)齒蚌(Anodonta woodiana)體內(nèi)的多種免疫酶活性隨pH 的改變而出現(xiàn)波動(dòng)變化，可能是為避免環(huán)境對(duì)機(jī)體的損傷而發(fā)生的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，也可能是由“毒物興奮效應(yīng)”所導(dǎo)致(Calabrese et al, 2005)。

綜上所述，在刺參“參優(yōu)1 號(hào)”苗種養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)保持水體pH 在7.5～8.5 范圍內(nèi)，苗種生長(zhǎng)速度較快，pH 過(guò)高或過(guò)低均會(huì)引起刺參的應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為生長(zhǎng)下降和存活率降低等現(xiàn)象，生理指標(biāo)表現(xiàn)為RO和RN升高以及免疫酶活性發(fā)生變化。因此，在良種推廣過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)相應(yīng)海域或養(yǎng)殖模式下的pH 周年變化范圍，選擇適宜的推廣區(qū)域并控制養(yǎng)殖管理工藝，避免暴雨、水體污染等自然或人為因素造成pH 大幅波動(dòng)，保障良種在適宜的環(huán)境條件下生長(zhǎng)，以獲得最佳的良種貢獻(xiàn)率。