趙 斌 胡 煒 李成林① 趙洪友吳 鵬 韓 莎 姚琳琳 王 琦

(1. 山東省海洋生物研究院 青島 266104；2. 萊陽(yáng)市海洋漁業(yè)有限公司 煙臺(tái) 265200;3. 文登市漁業(yè)技術(shù)推廣站 威海 264400)

刺參(Apostichopus j aponicus)是目前國(guó)內(nèi)沿海具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的棘皮類養(yǎng)殖品種，近年來(lái)，養(yǎng)殖區(qū)域不斷拓展，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益(李成林等, 2019)。隨著刺參產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，部分養(yǎng)殖業(yè)戶長(zhǎng)期累代自繁，造成苗種生長(zhǎng)遲緩、成活率低等現(xiàn)象，養(yǎng)殖刺參種質(zhì)退化日趨嚴(yán)重。同時(shí)，由于近年來(lái)極端天氣等災(zāi)害頻發(fā)，當(dāng)前養(yǎng)殖刺參種質(zhì)暴露出抗逆性差、應(yīng)對(duì)環(huán)境氣候突變風(fēng)險(xiǎn)能力薄弱等問(wèn)題，業(yè)內(nèi)亟待提升優(yōu)良種質(zhì)創(chuàng)新水平。鑒于此，國(guó)內(nèi)刺參育種科研與生產(chǎn)單位歷經(jīng)多年，相繼選育出具有生長(zhǎng)速度快、疣足數(shù)量多、耐高溫、抗病等優(yōu)異生產(chǎn)性狀的刺參新品種，為國(guó)內(nèi)刺參產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展奠定了種質(zhì)基礎(chǔ)。

鹽度是海水養(yǎng)殖環(huán)境中的重要生態(tài)因子，其變化對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和消化生理活動(dòng)有顯著影響(李剛等, 2011)，刺參的適宜鹽度一般在26～33(王吉橋等,2009; 孫秀俊等, 2012)。在刺參產(chǎn)業(yè)帶由傳統(tǒng)的自然分布區(qū)域向山東省黃河三角洲沿海地區(qū)拓展過(guò)程中，刺參養(yǎng)殖受到海區(qū)鹽度偏低或不穩(wěn)定的影響，本研究課題組經(jīng)多年選育，培育出耐鹽范圍廣、生長(zhǎng)快的刺參新品系，適宜在山東、遼寧、河北和福建等更廣闊區(qū)域養(yǎng)殖。目前，關(guān)于不同鹽度環(huán)境對(duì)刺參新品系生長(zhǎng)、攝食影響的研究報(bào)道并不多見(jiàn)，本研究以刺參耐鹽選育品系子四代(G4)和子五代(G5)群體為研究對(duì)象，研究了其在不同鹽度環(huán)境下的生長(zhǎng)、攝食和消化生理的變化，結(jié)果可為刺參新品種培育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為刺參耐鹽新品種的創(chuàng)制和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用刺參為山東省海洋生物研究院種質(zhì)資源研究中心培育的耐鹽品系子四代(G4)和子五代(G5)，2017 年3 月和2019 年4 月，分別選取各代選育刺參進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。苗種規(guī)格分別為[G4(30.1±2.2) g 和(60.2±3.8) g]，G5[(30.4±2.3) g 和(60.8±3.6) g]，分別暫養(yǎng)在整理箱中，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境(pH 為8.1～8.3，水溫為16℃～18℃)。暫養(yǎng)期間，日投喂刺參專用配合飼料1 次，投餌量為刺參總重的3%～5%，同時(shí)，按配合飼料與海泥重量比為1∶3 的比例搭配投喂海泥。選取表觀正常、肉刺完整挺直、健康無(wú)病的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與日常管理

設(shè)置18、20、22 三個(gè)低鹽處理組和35、37、39三個(gè)高鹽處理組，以鹽度31 的自然海水為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，用經(jīng)自然曝曬的自來(lái)水與自然海水混合的方式降低鹽度，每天調(diào)整2～3 個(gè)鹽度單位，直至達(dá)到實(shí)驗(yàn)鹽度，并在實(shí)驗(yàn)鹽度條件下對(duì)刺參進(jìn)行馴化養(yǎng)殖5 d。馴化結(jié)束后，禁食48 h，分別將20 頭實(shí)驗(yàn)刺參放置于整理箱(80 cm×60 cm×48 cm)中，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行組。實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣，每天全量換水，投喂等管理同上節(jié)。實(shí)驗(yàn)周期為30 d。

1.3 測(cè)定方法與數(shù)據(jù)計(jì)算

1.3.1 刺參生長(zhǎng)及攝食的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 d 停止投喂，稱量刺參初始體重W0(g)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)其體重最終值Wt(g)。稱重時(shí)，先將刺參取出陰干，吸干體表水分后稱量。t 為實(shí)驗(yàn)持續(xù)的時(shí)間(d)。刺參特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate, SGR, %/d)采用以下公式計(jì)算：

SGR=100×(lnWt-lnW0)/t

通過(guò)測(cè)定攝食率(Feeding rate, FR, %)考察鹽度對(duì)刺參攝食的影響，計(jì)算公式如下：

FR=2F/[t(Wt+W0)]×100%

W0為體重初始值(g)，Wt為測(cè)定值(g)，t 為實(shí)驗(yàn)時(shí)間(d)，F(xiàn) 為飼料總攝入量(g)。

1.3.2 刺參消化酶活力的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)刺參取出并排凈體腔內(nèi)海水，然后沿腹部剪開(kāi)，取出消化道，剔除呼吸樹(shù)，用超純水沖洗干凈，在-80℃超低溫冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取腸組織置于玻璃勻漿器中，加入10 倍體積預(yù)冷的超純水，在冰浴條件下勻漿 20 min，在高速冷凍離心機(jī)中(0 ℃～4 ℃,1000 r/min)離心30 min，所得上清液于冰箱保存，待測(cè)。蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活力分別采用鉬酸銨法、比濁法和黃嘌呤氧化酶法測(cè)定。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比較，以P＜0.05 作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 低鹽和高鹽環(huán)境對(duì)選育刺參生長(zhǎng)、存活與攝食的影響

2.1.1 G4 代選育刺參生長(zhǎng)與攝食情況 耐鹽品系G4 代選育刺參在高鹽環(huán)境和低鹽環(huán)境中的生長(zhǎng)攝食情況見(jiàn)表1。30 d 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，2 種不同規(guī)格選育刺參在低鹽環(huán)境中的末體重均隨著鹽度的降低而下降，鹽度18 實(shí)驗(yàn)組的選育刺參末體重均顯著低于其他鹽度組(P＜0.05)，且低于初始值，體重呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，鹽度20、22 實(shí)驗(yàn)組與鹽度31 實(shí)驗(yàn)組差異不顯著(P＞0.05)。體重SGR 與FR 最高的分別為鹽度31 實(shí)驗(yàn)組，分別為(0.83±0.07)%/d、(3.77±0.29)%/d，初始規(guī)格30 g 左右的其他低鹽實(shí)驗(yàn)組隨鹽度降低出現(xiàn)顯著下降；初始規(guī)格60 g 左右的低鹽實(shí)驗(yàn)組中，鹽度22 與31 實(shí)驗(yàn)組的SGR 與FR 差異不顯著，其他實(shí)驗(yàn)組隨鹽度降低出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)。

在高鹽實(shí)驗(yàn)條件下，2 種不同規(guī)格選育刺參末體重隨著實(shí)驗(yàn)鹽度升高而下降，其中，鹽度35、37 實(shí)驗(yàn)組與鹽度31 實(shí)驗(yàn)組差異不顯著(P＞0.05)，鹽度39實(shí)驗(yàn)組2 種規(guī)格刺參均出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。初始規(guī)格30 g左右的高鹽實(shí)驗(yàn)組SGR 與FR 隨鹽度升高出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)，鹽度39 實(shí)驗(yàn)組的SGR 為(-0.17±0.02)%/d，F(xiàn)R 為(0.15±0.02)%，均為最低值；規(guī)格60 g 左右的高鹽實(shí)驗(yàn)組SGR 與FR 呈現(xiàn)類似的規(guī)律。

2.1.2 G5 代選育刺參生長(zhǎng)與攝食情況 耐鹽品系

G5 代選育刺參在高鹽環(huán)境和低鹽環(huán)境中的生長(zhǎng)攝食情況見(jiàn)表2。由表2 可知，30 d 實(shí)驗(yàn)中，G5 代2 種規(guī)格選育刺參在低鹽環(huán)境中的生長(zhǎng)情況與G4 代相似，末體重隨著實(shí)驗(yàn)鹽度的降低而下降，但僅鹽度18 實(shí)驗(yàn)組顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。2 種規(guī)格低鹽實(shí)驗(yàn)組SGR 與FR 隨鹽度降低出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)，但鹽度22 實(shí)驗(yàn)組中，初始體重為60 g 實(shí)驗(yàn)組刺參的SGR 與鹽度31 組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表1 選育G4 代刺參在低鹽和高鹽環(huán)境下攝食、生長(zhǎng)情況Tab.1 Growth and feeding of G4 breeding sea cucumber in low and high salinity environments

表2 選育G5 代刺參在低鹽和高鹽環(huán)境下攝食、生長(zhǎng)情況Tab.2 Growth and feeding of G5 breeding sea cucumber in low and high salinity environments

在高鹽環(huán)境中，2 種不同規(guī)格選育刺參末體重均隨著實(shí)驗(yàn)鹽度升高而下降，其中，初始體重30 g 實(shí)驗(yàn)組刺參在鹽度35 時(shí)末體重最高，增至(39.5±3.2) g，但與鹽度31 對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。在2 種不同規(guī)格選育刺參高鹽環(huán)境下SGR 與FR 測(cè)定結(jié)果中，鹽度35 實(shí)驗(yàn)組與鹽度31 對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，當(dāng)鹽度升至37 和39 時(shí)，其SGR 和FR 均隨鹽度升高而顯著降低(P＜0.05)。

2.2 低鹽和高鹽環(huán)境對(duì)選育刺參消化酶活力的影響

2.2.1 低鹽和高鹽環(huán)境中G4 和G5 代選育刺參蛋白酶活力 鹽度對(duì)G4 和G5 代選育刺參蛋白酶活力的影響如圖1 所示，L 為初始體重30 g 左右個(gè)體，B為初始體重60 g 左右個(gè)體。在鹽度18～31 范圍內(nèi)，G4 和G5 代的不同規(guī)格選育刺參消化道蛋白酶活力隨著設(shè)置鹽度的降低而下降，最低值為G5 代鹽度18小規(guī)格刺參實(shí)驗(yàn)組的1.55 U/mg prot；其中，鹽度18和鹽度20 實(shí)驗(yàn)組蛋白酶活力顯著低于鹽度22 實(shí)驗(yàn)組和鹽度31 對(duì)照組(P＜0.05)，而鹽度22 和鹽度31 對(duì)照組之間差異不顯著(P＞0.05)。在鹽度31～39 范圍內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組刺參蛋白酶活力隨著設(shè)置鹽度的升高呈降低趨勢(shì)，但鹽度35、37 實(shí)驗(yàn)組的蛋白酶活力與鹽度31 對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)，G5 代2 種規(guī)格實(shí)驗(yàn)刺參在鹽度37 和39 的蛋白酶活力差異亦不顯著(P＞0.05)。

2.2.2 低鹽和高鹽環(huán)境中G4 和G5 代選育刺參淀粉酶活力 鹽度對(duì)G4 和G5 代選育刺參淀粉酶活力的影響見(jiàn)圖2，L 為初始體重30 g 左右個(gè)體，B 為初始體重60 g 左右個(gè)體。在鹽度18～39 范圍內(nèi)，G4 和G5 代的不同規(guī)格選育刺參消化道淀粉酶活力隨著設(shè)置鹽度的變化而起伏，總體無(wú)太大差異。在G4 代實(shí)驗(yàn)組中，鹽度37 實(shí)驗(yàn)組小規(guī)格刺參淀粉酶活力為0.36 U/mg prot，顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，鹽度22 與鹽度37 的小規(guī)格刺參淀粉酶活力顯著超過(guò)大規(guī)格刺參；在G5 代實(shí)驗(yàn)組中，淀粉酶活力峰值出現(xiàn)在鹽度22 小規(guī)格實(shí)驗(yàn)組，最低值出現(xiàn)在鹽度39 小規(guī)格實(shí)驗(yàn)組，為0.12 U/mg prot，同一鹽度下2 種規(guī)格間的淀粉酶活力均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

圖1 鹽度環(huán)境對(duì)G4 和G5 代選育刺參蛋白酶活力的影響Fig.1 The effects of different salinity on the protease activity of G4 and G5 breeding sea cucumber

圖2 鹽度環(huán)境對(duì)G4 代和G5 代選育刺參淀粉酶活力的影響Fig.2 The effects of different salinity on the amylase activity of G4 and G5 breeding sea cucumber

2.2.3 低鹽和高鹽環(huán)境中G4 和G5 代選育刺參脂肪酶活力 鹽度對(duì)G4 和G5 代選育刺參脂肪酶活力的影響見(jiàn)圖3，L 為初始體重30 g 左右個(gè)體，B 為初始體重60 g 左右個(gè)體。在鹽度18～31 范圍內(nèi)，G4 和G5 代的不同規(guī)格選育刺參消化道脂肪酶活力隨著設(shè)置鹽度的降低而下降，其中，鹽度18 和鹽度22 實(shí)驗(yàn)組脂肪酶活力顯著低于鹽度31 對(duì)照組(P＜0.05)，而鹽度22 和鹽度31 對(duì)照組之間差異不顯著(P＞0.05)。在鹽度31～39 范圍內(nèi)，G4 和G5 代不同規(guī)格的鹽度35實(shí)驗(yàn)組的脂肪酶活力與鹽度31 對(duì)照組差異均不顯著(P＞0.05)，鹽度37 實(shí)驗(yàn)組脂肪酶活力值有所下降，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，當(dāng)鹽度環(huán)境為39 時(shí)，各組實(shí)驗(yàn)刺參脂肪酶活力出現(xiàn)顯著下降，最低值為G5 代鹽度39 大規(guī)格刺參實(shí)驗(yàn)組的0.18 U/mg prot。

圖3 鹽度環(huán)境對(duì)G4 代和G5 代選育刺參脂肪酶活力的影響Fig.3 The effects of different salinity on the lipase activity of G4 and G5 breeding sea cucumber

3 討論

3.1 刺參選育品系在低鹽和高鹽環(huán)境下的生長(zhǎng)與攝食情況

鹽度是影響水產(chǎn)動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)的重要環(huán)境因子，與其生長(zhǎng)、發(fā)育關(guān)系密切(Talbot et al, 2002; Dong et al, 2008)。刺參屬于典型的狹鹽性棘皮動(dòng)物，鹽度的變化對(duì)刺參的生長(zhǎng)、存活和繁殖等一系列生理活動(dòng)均有影響(陳勇等, 2007; 鄭慧等, 2014; Li et al, 2010;胡煒等, 2012; 于姍姍等, 2012)。研究表明，鹽度變化存在影響刺參生長(zhǎng)的拐點(diǎn)，超過(guò)拐點(diǎn)數(shù)值刺參生長(zhǎng)將大幅降低，鹽度低于22 時(shí)，刺參3.5 g 左右幼參出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)(王吉橋等, 2009)，鹽度36 時(shí)，規(guī)格為37.5 g的刺參特定生長(zhǎng)率顯著低于鹽度 31 時(shí)(孟雷明等,2013)。本研究通過(guò)2 代不同規(guī)格刺參在低鹽和高鹽環(huán)境中的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選育刺參品系同樣存在生長(zhǎng)拐點(diǎn)，分別在鹽度20 和鹽度37 時(shí)，此條件下的選育刺參雖仍可生長(zhǎng)，但體質(zhì)量增長(zhǎng)與特定生長(zhǎng)率均與對(duì)照環(huán)境下出現(xiàn)顯著差異，當(dāng)鹽度差異繼續(xù)加劇時(shí)，便會(huì)出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。在刺參人工選育品種和其他種內(nèi)群體品種方面，包杰等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，日本紅刺參在鹽度升高至38 或降低至23 時(shí)的能量代謝特征不利于其生長(zhǎng)；朱厚祥等(2013)發(fā)現(xiàn)，白刺參與普通刺參幼蟲(chóng)階段相同鹽度耐受程度相近，在高鹽度37 下成活率和生長(zhǎng)率均較低。因此，在養(yǎng)殖鹽度的適應(yīng)性方面，本研究耐鹽選育品系刺參相對(duì)普通刺參及部分無(wú)耐鹽性狀的選育品種有優(yōu)勢(shì)。

良種是產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的基礎(chǔ)，連續(xù)多代選擇可以有效純化動(dòng)植物優(yōu)良性狀，大多可以獲得積極的選擇反應(yīng)，從而培育出良種(劉石林, 2015; 樓允東, 1999)。在良種缺乏和異常氣候環(huán)境變化背景下，開(kāi)展刺參抗逆品種的選育工作是長(zhǎng)期以來(lái)國(guó)內(nèi)刺參領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)(李成林等, 2019)，特定性狀的定向選育是改善刺參對(duì)惡劣環(huán)境抗逆能力的有效手段(隋凱港等,2014)。水產(chǎn)動(dòng)物選育新品種通過(guò)審定一般至少應(yīng)經(jīng)過(guò)4 個(gè)世代以上，本研究所采用的G4、G5 代刺參耐鹽選育品系在相同鹽度環(huán)境下表現(xiàn)出的生長(zhǎng)與攝食性能極為相似，表明新品系的選育性狀穩(wěn)定性較強(qiáng)，對(duì)刺參耐鹽新品種的獲得及其后的推廣應(yīng)用具有積極的意義。

3.2 刺參選育品系在低鹽和高鹽環(huán)境下的消化生理

消化酶活性與水產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)吸收關(guān)聯(lián)密切，進(jìn)而影響水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)(田宏杰等, 2006)。同時(shí)，鹽度對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物消化酶的影響已被廣泛報(bào)道(黃凱等,2007; 陳品健等, 1998; 莊平等, 2008)，且各類消化酶的最適鹽度存在差異(孫雙雙等, 2009; 范超晶等,2016)。刺參雖然沒(méi)有消化腺，但其消化道內(nèi)具有多種重要的消化酶(唐黎等, 2007; 馮丹等, 2014)。本研究表明，低鹽和高鹽環(huán)境對(duì)選育刺參品系的消化酶均存在顯著影響，且蛋白酶與脂肪酶活力的消長(zhǎng)規(guī)律與個(gè)體生長(zhǎng)與攝食呈現(xiàn)相關(guān)性。3 種酶活力中以蛋白酶活力最高，結(jié)果與李剛等(2011)在研究普通刺參時(shí)的結(jié)論一致。在激活消化酶活力的鹽度值方面本研究結(jié)果則與已往報(bào)道不同。本研究中，蛋白酶活力最高時(shí)的鹽度為31，而淀粉酶活力的2 個(gè)峰值大致在鹽度22 和37。孫雙雙等(2009)研究得出，普通刺參淀粉酶與蛋白酶最適鹽度為30，纖維素酶最適鹽度為26，脂肪酶受鹽度影響較小，而李剛等(2011)在研究8 g左右的幼參得出的結(jié)果則是蛋白酶活力在鹽度29 時(shí)最高，淀粉酶活力在鹽度32 時(shí)最高，前腸脂肪酶活力在鹽度32 時(shí)最高，中腸在鹽度29 時(shí)最高，均與本研究有所不同，分析原因主要是由于選育群體經(jīng)歷代幾定向選育，對(duì)在不同鹽度的生活習(xí)性方面可能與普通刺參產(chǎn)生了遺傳差異，而這種差異在子代中保持著較高的穩(wěn)定性，雖然G5 代耐鹽刺參品系與G4 代的遺傳進(jìn)展不明顯，但這種遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)出對(duì)更大范圍鹽度的適應(yīng)性，從遺傳改良角度上考慮更具有生產(chǎn)應(yīng)用潛力。