李 彬 王印庚① 廖梅杰 張永剛 榮小軍王錦錦 于永翔 張 正 寧魯光

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071；2. 山東海躍水產(chǎn)科技有限公司 東營 257500)

仿刺參(Apostichopus j aponicus)又稱刺參，是池塘或淺海中增養(yǎng)殖的重要海洋經(jīng)濟動物。近年來，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)規(guī)模的迅速擴大，病害頻發(fā)問題已成為產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸因子之一。對刺參病害的研究顯示，腐皮綜合征是刺參育苗和養(yǎng)殖過程中的最主要病害。病原學(xué)研究表明，細菌性病原如燦爛弧菌(Vibrio splendidus)(張春云等, 2006)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas ni grifaciens)(王印庚等,2006)是該疾病的重要致病原。池塘養(yǎng)殖是刺參養(yǎng)殖的最主要養(yǎng)殖模式，由于刺參養(yǎng)殖池塘面積較大，使用藥物進行病害防控的可操作性受限制，利用微生態(tài)制劑進行池塘水環(huán)境和刺參生理狀態(tài)調(diào)控是防控池塘養(yǎng)殖刺參腐皮綜合征的重要途徑。

乳酸菌制劑是一類不運動、無芽孢、產(chǎn)生大量乳酸的天然活性微生態(tài)制劑，能粘附于腸黏膜、改善腸道菌群、增強免疫，并抑制病原菌在腸道的定殖，降解水體中的氨氮(-N)、亞硝酸鹽(N)等有害物質(zhì)，具有作為益生菌的巨大潛力，是近年來養(yǎng)殖動物疾病生態(tài)防控應(yīng)用熱點(Cavalcante et al, 2020; Wang et al, 2015; Zhao et al, 2016; Peng et al, 2020)。乳酸菌在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用較為成熟，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用尚處在探索階段。目前，相關(guān)研究初步揭示了乳酸菌對養(yǎng)殖動物的增重率、免疫力以及水質(zhì)的影響。Li等(2018)將植物乳桿菌(Lactobacillus p lantarum)及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)添加到刺參飼料中，對刺參生長及免疫均具有良好的促進作用，林艾影等(2020)研究表明，乳酸菌能顯著提高軍曹魚(Rachycentron canadum)幼魚增重率、特定生長率以及淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶的活性；王國霞等(2010)在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei )飼料中添加乳酸菌，可提高溶菌酶和血清過氧化氫酶的活性，然而，關(guān)于乳酸菌對刺參病害防控的研究鮮有報道。目前，市場上的乳桿菌產(chǎn)品多為從其他區(qū)域或物種分離獲得，從微生態(tài)制劑生態(tài)安全性的角度來看，自養(yǎng)殖動物本身或生長環(huán)境中篩選土著菌，開發(fā)土著菌的應(yīng)用潛能，具有更好的環(huán)境適用性和更高的使用安全性。鑒于此，本研究從山東東營地區(qū)刺參池塘環(huán)境中篩選對刺參安全的土著乳酸菌并開展其生長特性評價，以期為刺參池塘病害生態(tài)防控提供應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 養(yǎng)殖池塘選擇 選取位于山東省東營市海躍水產(chǎn)科技有限公司池塘培育的大規(guī)格刺參苗種，池塘面積約為4 hm2，水深為1.5～2 m，池塘附著基由遮陰網(wǎng)搭建而成，該池塘為使用1.5 年的池塘，投苗規(guī)格為1～2 g/頭，苗種投放密度為2 萬頭/畝，春、秋季苗種攝食旺盛期投餌，餌料成分為鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、海帶(Laminaria japonica)等藻粉。

1.1.2 樣品的采集 2018 年10 月采集底泥樣本。采樣時，養(yǎng)殖池水溫度為20℃，鹽度為29；采集地點選擇在養(yǎng)殖池中央池底，使用采集器采集池底沉積物，選取表層為5 cm 的上層底泥為測試樣本，樣本采集后于4℃保存，低溫運回實驗室。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母提取物2.5 g，氯化鈉5.0 g，加蒸餾水定容至1000 ml。

MRS 固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉浸粉5.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，醋酸鈉5.0 g，磷酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂15.0 g，吐溫80 1.0 g，加蒸餾水定容至1000 ml。

MRS 液體培養(yǎng)基：配方同MRS 固體培養(yǎng)基，不加瓊脂。

1.1.4 拮抗指示用病原菌 刺參腐皮綜合征的2 株重要的細菌性致病原——燦爛弧菌和假交替單胞菌為本實驗室保存的分離自患病刺參的病原菌。

1.1.5 安全性評價用刺參苗種 安全性評價實驗所用健康刺參購自東營市海躍水產(chǎn)科技有限公司，苗種平均規(guī)格為(22.67±2.56) g/頭。運抵實驗室后暫養(yǎng)7 d，用于后續(xù)實驗。暫養(yǎng)條件：水溫為16℃，鹽度為28，pH 為7.9。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)與分離 將采集的底泥樣本加入50 ml 1.5%的滅菌NaCl 溶液進行充分稀釋溶解，靜置20 min 后，吸取上清液，利用1.5%的滅菌NaCl溶液進行10 倍梯度稀釋后，在MRS 平板上進行涂布，恒溫培養(yǎng)箱進行細菌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，倒置培養(yǎng)24～48 h，選取適宜稀釋度的平板進行菌落計數(shù)，單菌落分離、純化和保種，并對保種的菌落于-80℃保存。1.2.2 拮抗菌的篩選 將活化的燦爛弧菌和假交替單胞菌涂布于牛津杯打孔的LB 平板上，向牛津杯小孔添加150 μl 濃度為1×108CFU/ml 培養(yǎng)的相應(yīng)乳酸菌菌液，37℃培養(yǎng)24～36 h，測定牛津杯小孔的抑菌圈直徑。選取對2 株致病菌具有最佳抑菌效果的乳酸菌作為候選益生菌，用于下一步實驗。

1.2.3 所篩選乳酸菌產(chǎn)生的胞內(nèi)產(chǎn)物及胞外產(chǎn)物抑菌效果

(1)胞內(nèi)產(chǎn)物及胞外產(chǎn)物的制備 對以MRS 液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)獲得的候選益生菌培養(yǎng)液進行離心，4500 r/min 離心15 min，采用直徑為0.22 μm 的濾膜過濾上清液，得到的過濾液即供試菌胞外產(chǎn)物；離心獲得的菌泥使用滅菌的PBS 沖洗3 次，再用超聲波方法進行破碎，制備胞內(nèi)產(chǎn)物。

(2)胞內(nèi)產(chǎn)物及胞外產(chǎn)物抑菌效果比較 將活化的燦爛弧菌和假交替單胞菌涂布于牛津杯打孔的LB平板上，向牛津杯小孔添加150 μl 制備的胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物，37℃培養(yǎng)24～36 h，測定牛津杯小孔的抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈直徑確定胞內(nèi)產(chǎn)物及胞外產(chǎn)物對致病原的抑菌效果。

1.2.4 候選益生菌對刺參的安全性評價 將暫養(yǎng)穩(wěn)定后的刺參苗種隨機分到容積為20 L 的12 個實驗水槽中，每個水槽放置20 頭苗種，實驗分為4 組，即1 個對照組和3 個實驗組，每個組設(shè)3 個平行。安全性實驗采用浸浴的方式進行，候選益生菌的浸浴濃度分別設(shè)定為1×107、1×108和1×109CFU/ml，以不添加候選益生菌的3 個水槽作為對照組。安全性實驗周期為30 d，日投餌量為刺參體重的1%，每天投喂1 次，水溫為16℃～18℃、鹽度為29，每天換水量為20%，換水后及時補充新培養(yǎng)的益生菌以維持相應(yīng)的浸浴濃度。實驗期間，每天記錄刺參活動、攝食、吐臟及死亡情況。

1.2.5 菌株的生理生化鑒定 采用細菌微量生化鑒定管(青島海博生物)對所篩選的菌株進行生理生化指標的測試。測試結(jié)果與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠等, 2001)和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》(凌代文等, 1999)進行對比歸類后判定菌株類型。

1.2.6 菌株的16S rDNA 序列分析 利用細菌基因組DNA 提取試劑盒(北京天根生物)提取菌株基因組DNA。采用細菌16S rDNA 通用引物擴增基因組DNA，引物序列為27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，擴增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，送青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果通過Blast 檢索程序與NCBI 基因庫中相關(guān)序列進行比對，并利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 菌株生長特性研究

(1)溫度對菌株生長的影響 分別設(shè)定溫度為9℃、16℃、23℃、30℃、37℃、44℃、51℃和58℃，將所篩選的菌株接種于300 ml MRS 液體培養(yǎng)基中，置于設(shè)置了相應(yīng)溫度條件的細菌振蕩培養(yǎng)箱中，180 r/min 恒溫培養(yǎng)24 h，對菌液中的培養(yǎng)細菌計數(shù)(劉宇等, 2017)，確定菌株的最適溫度。

(2) pH 對菌株生長的影響 分別設(shè)定pH 為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，用1 mol/L的NaOH 和HCl 溶液將MRS 液體培養(yǎng)基分別調(diào)至相應(yīng)pH 條件，所篩選的菌株接種于300 ml 相應(yīng)的MRS液體培養(yǎng)基中，180 r/min 恒溫培養(yǎng)24 h，對菌液中的培養(yǎng)細菌計數(shù)(周映華等, 2015)，確定菌株最適pH。

(3)菌株生長曲線的繪制 依據(jù)上述實驗確定菌株最適生長pH 值和生長溫度，將篩選的菌株接種于300 ml 相應(yīng)的pH 條件的MRS 液體培養(yǎng)基中，設(shè)定培養(yǎng)箱溫度為最適生長溫度，按照180 r/min 的轉(zhuǎn)速進行振蕩培養(yǎng)52 h。培養(yǎng)期間，每隔4 h 取樣1 次，測定相應(yīng)節(jié)點的細菌濃度并繪制該菌株的生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌的篩選

本研究從山東東營刺參養(yǎng)殖池塘環(huán)境中分離獲得56 株乳酸菌，分別編號為CSND-1、CSND-2、CSND-3、…CSND-56。通過對指示菌的拮抗實驗，篩選出1 株對燦爛弧菌和假交替單胞菌的生長具有良好抑制作用的乳酸菌CSND-6(圖1)。該菌株的菌落表面光滑、邊緣清晰、中央隆起，呈乳白色。革蘭氏染色陽性，透射電鏡觀察表明，該菌呈短桿狀，為1.5～2.0 μm，兩端鈍圓，無鞭毛，無芽孢(圖2)。

圖1 菌株CSND-6 對刺參重要病原菌的抑制作用Fig.1 The antagonistic activities of strain CSND-6 to main pathogens of sea cucumber

圖2 菌株CSND-6 的革蘭氏染色和透射電鏡觀察Fig.2 Gram’s staining and TEM photograph of the strain CSND-6

2.2 菌株胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物的抑菌效果比較

利用所篩選的CSND-6 制備該菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物，測定該菌株對燦爛弧菌和假交替單胞菌的抑菌圈大小見圖3 和表1。從圖3 和表1 可以看出，胞內(nèi)產(chǎn)物對燦爛弧菌、假交替單胞菌的抑菌圈分別為17、22 mm，胞外產(chǎn)物的抑菌圈分別為25、31 mm，說明候選菌株CSND-6 的胞內(nèi)、胞外產(chǎn)物對指示菌的生長均具有較強的抑制作用。

圖3 菌株CSND-6 胞內(nèi)及胞外產(chǎn)物對刺參重要病原菌的抑制作用Fig.3 The antagonistic activities of intracellular products and extracellular products of strainCSND-6 to main pathogens of sea cucumber

表1 菌株CSND-6 胞內(nèi)及胞外產(chǎn)物對刺參重要病原菌的抑制作用Tab.1 The antagonistic activities of intracellular products and extracellular products of strain CSND-6 to main pathogens of sea cucumber

2.3 安全性實驗

采用不同濃度的CSND-6 菌液對刺參苗種的浸浴脅迫實驗的安全性結(jié)果見表2。從表2 可以看出，浸浴濃度分別為1.0×107、1.0×108、1.0× 109CFU/ml 的高濃度脅迫實驗組，在整個實驗過程中，刺參苗種活力良好，攝食正常，均未發(fā)現(xiàn)排臟、發(fā)病和死亡的現(xiàn)象，表明該CSND-6 菌株對刺參苗種是安全的。

表2 菌株CSND-6 的刺參的安全性實驗Tab.2 Safety testing of strain CSND-6 to sea cucumber A. japonicus

2.4 生理生化鑒定

對篩選的乳酸菌CSND-6 進行生理生化檢測，該菌在3% NaCl 尿素酶、3% NaCl ONPG、苦杏仁苷、丙二酸鹽條件下呈陽性，能利用葡萄糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇；氧化酶反應(yīng)呈陰性，該菌株不液化明膠，不產(chǎn)生H2S 氣體。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠等, 2011)和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》(凌代文等, 1999)，該菌株屬乳桿菌科(Lactobacillaceae)(表3)。

2.5 菌株16S rDNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對菌株CSND-6 16S rDNA 的相應(yīng)序列進行擴增、測序獲得該菌株的16S rDNA 序列為1414 bp。通過Blast 檢索程序與NCBI 基因庫中序列進行比對分析，并使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。從圖4 可以看出，本研究分離獲得的菌株CSND-6 與副干酪乳桿菌(Lactobacillus pa racaseiJCM1171)的相似性最高，為99.83%。

表3 菌株CSND-6 的生理生化特征Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of strain CSND-6

圖4 基于16S rDNA 序列的菌株CSND-6 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of strain CSND-6 based on 16S rDNA sequence

2.6 菌株的生長特性

2.6.1 溫度對菌株生長的影響 測定不同溫度對菌株生長的影響見圖5。從圖5 可以看出，在9℃～58℃的實驗范圍內(nèi)，菌株的生長速度隨培養(yǎng)溫度的升高呈先增高再降低的趨勢，該菌株在9℃～51℃范圍內(nèi)均可生長，58℃時不生長；30℃～44℃溫度范圍內(nèi)生長較快，最適宜的生長溫度為37℃。

2.6.2 不同pH 條件對菌株生長的影響 不同pH的MRS 培養(yǎng)基中菌株CSND-6 的培養(yǎng)結(jié)果見圖6。從圖6 可以看出，菌株CSND-6 在pH 為2.0 和10.0時不生長；在pH 為3.0～9.0 范圍內(nèi)均可以生長；在pH 為6.0～8.0 范圍內(nèi)，菌落數(shù)量明顯高于其他組，pH為7.0 時生長速度最快。

圖5 不同溫度下菌株CSND-6 的生長情況Fig. 5 Growth of strain CSND-6 in different temperature

圖6 不同pH 對菌株CSND-6 生長的影響Fig. 6 Effect of different pH on the growth of strain CSND-6

圖7 菌株CSND-6 在不同時間的生長曲線Fig. 7 Growth curve of strain CSND-6 in different time

2.6.3 生長曲線 以上述實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，確定該菌株的最適培養(yǎng)溫度為37℃，最適菌株生長的pH 為7.0。按照這一條件配制pH 為7.0 的MRS 培養(yǎng)基，繪制其在37℃培養(yǎng)的生長曲線見圖7。根據(jù)CSND-6的生長曲線可以看出，CSND-6 在16 h 之前生長速度較慢，16 h 后快速生長并進入對數(shù)生長期，28～32 h期間處于生長高峰期，其中，28 h 時菌落數(shù)達到峰值，菌落數(shù)為2.10×109CFU/ml，32 h 后CSND-6 生長速度下降，36 h 后開始進入平臺期。

3 討論

乳酸菌廣泛分布于動物腸道中，能阻礙腸道內(nèi)特定致病菌的粘附和定殖，從而起到調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡及抑制病原菌的作用(Guo et al, 2020)。目前，乳酸菌已經(jīng)應(yīng)用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖的病害防治過程并對其抑菌機理進行了研究。Atanassova 等(2003)研究表明，副干酪乳桿菌(L.paracasei subsp M3)能分泌1 種抗菌素，抑制細菌、真菌生長；Ashokkumar 等(2011)研究表明，副干酪乳桿菌產(chǎn)生的細菌素粗提物對鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)具有較強的抑制作用。本研究從山東東營刺參養(yǎng)殖池塘底泥樣品中分離獲得1 株具有顯著抑菌活性的副干酪乳桿菌，該菌胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物對刺參腐皮綜合征重要的致病原假交替單胞菌和燦爛弧菌均具有較好的抑菌活性，表明篩選的副干酪乳桿菌在池塘養(yǎng)殖的病害防控中具有良好的應(yīng)用潛力。

掌握乳酸菌發(fā)酵條件及生長規(guī)律可對后期開發(fā)利用提供重要參考。本研究通過對篩選菌株——副干酪乳桿菌發(fā)酵條件和生長曲線的研究，確定了副干酪乳桿菌CSND-6 最適生長條件，溫度為37℃，pH 為7.0，且在16 h 后進入對數(shù)生長期，28～32 h 達到生長高峰期，28 h 時活菌數(shù)量達到高峰，為2.10×109CFU/ml。數(shù)據(jù)與劉宇等(2017)從新鮮的驢糞中獲得1 株驢源干酪乳桿菌LV1 所測定的生物學(xué)特性相似。唐素婷等(2019)對1 株分離自醬油渣的副干酪乳桿菌的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)菌株進入對數(shù)生長期的時間(12 h)比本研究篩選的菌株時間短，但進入生長高峰期的時間(30 h)較長。通過以上研究可以看出，本研究篩選出的副干酪乳桿菌CSND-6 生長的溫度、酸堿度的范圍較廣，并且進入高峰期的活菌數(shù)量大，適宜于產(chǎn)品的開發(fā)和池塘養(yǎng)殖環(huán)境的推廣應(yīng)用。

益生菌能調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體的微環(huán)境、改善水質(zhì)條件、抑制病原菌生長，在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的疾病防控過程中已初見成效，但養(yǎng)殖水域使用大量益生菌并釋放到公共環(huán)境中對生態(tài)環(huán)境的安全不容忽視。Wang等(2000)研究表明，在養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)中發(fā)現(xiàn)1 種新的細菌性白斑病，該病是由大量使用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)而引發(fā)；駱藝文等(2009)研究發(fā)現(xiàn)，大量使用益生菌——蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)可引起刺參化皮。因此，養(yǎng)殖過程中益生菌來源的選取及益生菌制劑的科學(xué)實用對安全生產(chǎn)也十分重要。

本研究篩選的抑制刺參重要病原菌的副干酪乳桿菌CSND-6 在高濃度浸浴脅迫刺參時，實驗刺參均健康、活力好，無吐臟、化皮和死亡現(xiàn)象，表明該菌對刺參是安全的。關(guān)于副干酪乳桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的應(yīng)用方面，夏雨等(2020)研究發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦飼料中添加副干酪乳桿菌，能提升對蝦肌肉持水性及EPA、DHA 含量，降低肌肉中飽和脂肪酸含量；Cazorla等(2015)研究表明，副干酪乳桿菌堅韌亞種(L. paracasei subsp. Tolerans)能提高虹鱒(Oncorhynchus mykiss)幼魚的生長性能并改善其腸道菌群；桂琳等(2015)在草魚(Ctenopharyngodon i della)飼料中加入干酪乳桿菌等益生菌的實驗結(jié)果表明，相應(yīng)菌株可以顯著提高草魚的生長速度，并提高消化酶和抗氧化酶活性。張永剛等(2019)自刺參池塘中篩選到1 株對刺參安全且具有良好抑菌效果的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。本研究所分離的副干酪乳桿菌CSND-6 對養(yǎng)殖刺參的生長、消化酶活性以及對養(yǎng)殖環(huán)境的調(diào)控作用還需進一步的研究探討。

綜上所述，本研究從山東東營地區(qū)刺參池塘養(yǎng)殖環(huán)境中篩選土著益生菌——副干酪乳桿菌CSND-6，該菌具有生長溫度范圍廣、抑菌能力強的特點，在刺參池塘養(yǎng)殖環(huán)境中快速繁殖形成優(yōu)勢菌并發(fā)揮作用的潛能。相關(guān)研究對池塘養(yǎng)殖的病害防控具有重要意義，為水產(chǎn)動物乳酸菌類微生態(tài)制劑的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。