譚八梅 王 犖 裴泓霖 夏興龍 丁 君 常亞青 郝振林

(大連海洋大學 農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室 大連 116023)

刺參(Apostichopus japo nicus)是具有較高經濟、營養(yǎng)及藥用價值的海水養(yǎng)殖生物(陳士國, 2010; Roggatz et al, 2018; 曹榮等, 2020)。池塘養(yǎng)殖作為一種重要的刺參增養(yǎng)殖模式，已經成為刺參養(yǎng)殖產業(yè)的重要組成部分(趙艷芳等, 2018)。然而，隨著刺參養(yǎng)殖產業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖水體的污染問題日益嚴重，對養(yǎng)殖生物產生了一定危害。

養(yǎng)殖池塘水體的微生物群落，不僅在水體物質與能量循環(huán)中具有重要作用，而且對養(yǎng)殖生物的健康存在直接或間接的影響(王鑫毅等, 2019)。深入研究水體微生物結構及功能，不僅可以了解微生物對養(yǎng)殖生物的影響，也可以利用微生物的特有性質和功能改善水質條件。目前，利用水體微生物某些特性，對水中污染物進行轉移、轉化及降解等一系列生物處理方法和技術，已得到廣泛的認可和利用(付戰(zhàn)勇等, 2019)。

刺參作為海洋生物，水體環(huán)境是其生存生長的主要場所，也是刺參病原菌來源的主要途徑(孫靜等,2019)。近年來，關于刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群的研究工作越來越受到研究者關注。Gao 等(2010)在研究刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構時發(fā)現(xiàn)，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)等是池塘水體中主要優(yōu)勢菌，相對豐度為69.01%～97.21%。竇研等(2016)對普蘭店、莊河、旅順不同地區(qū)刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構特征研究結果顯示，所調查區(qū)域水體優(yōu)勢菌門均為變形菌門和擬桿菌門。關曉燕等(2010)對遼寧普蘭店高溫季節(jié)刺參養(yǎng)殖水體菌群結構特征的研究表明，6～9 月水體細菌數(shù)量不斷上升，且優(yōu)勢菌主要隸屬于變形菌門。

目前，已有的研究大多是基于形態(tài)學觀察及純培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法(馮振飛等, 2008; 高菲等, 2010; 李彬等, 2010)，具有一定的局限性，不能準確全面地反映養(yǎng)殖環(huán)境中微生物群落結構的真實情況。近年來，高通量測序技術結合生物信息學方法，為全面解析菌群結構和功能特征開啟新途徑(溫崇慶等, 2016; 劉開輝等, 2017; 肖漢玉等, 2019; 來守超等, 2020)。

本研究選取遼寧長海刺參養(yǎng)殖池塘作為研究對象，利用高通量測序技術，解析不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構與功能特征，以期為刺參養(yǎng)殖池塘水體微生態(tài)調控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣選取的刺參養(yǎng)殖池塘僅養(yǎng)殖刺參單一品種，且全年不投喂微生態(tài)制劑。池塘面積約為0.1 km2，水深為2～3 m，水源來自近海海域，利用潮汐帶來的潮差進水和排水。分別于2019 年3 月(春季)、6 月(夏季)、9 月(秋季)和12 月(冬季)，利用玻璃采水器采集遼寧長海(39°16′42″N，122°36′5″E)同一刺參養(yǎng)殖池塘上層(離水面30 cm 處)和下層(離池底30 cm 處)水樣各4 L，低溫條件下帶回實驗室。水樣經0.8 μm 無菌濾膜抽濾后，測定水質指標；再經0.22 μm 醋酸纖維素濾膜抽濾，濾膜用于細菌總DNA 的提取。

1.2 環(huán)境因子的測定

采用HACH(HQd)水質分析器，現(xiàn)場測定鹽度(S)、溫度(T)、酸堿度(pH 值)、溶解氧(DO)、氧化還原電位(ORP)?？偟?TN)、總磷(TP)、氨氮(-N)、硝酸鹽(-N)、亞硝酸鹽(-N)、磷酸鹽(-P)等理化參數(shù)測定按照GB17378-2007 海洋監(jiān)測規(guī)范進行。

1.3 DNA 提取

選用OMEGA Soil DNA 試劑盒提取刺參養(yǎng)殖池塘水體樣品總DNA，使用NanoDrop 2000 超微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA 的濃度、純度和完整性。

1.4 PCR 擴增與高通量測序

細菌16S rRNA 基因V3～V4片段的擴增引物為341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806R (5′-G GACTACHVGGGTATCTAAT-3′)，應用Illumina MiSeq測序平臺完成序列測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 Usearch 軟件，以 97%閾值開展 OTUs(Operational taxonomic units)操作分類單元聚類。采用RDPclassifier 軟件以閾值0.8 進行物種分類操作，低于該閾值的分類結果劃歸為Unclassified 一類。利用Mothur 軟件進行多樣性分析?；谖锓N分類結果，得到在不同水平上各Rank 的豐度值，采用STAMP軟件，比較樣本或組間豐度差異，篩選條件為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 環(huán)境因子監(jiān)測

遼寧長海刺參養(yǎng)殖池塘不同季節(jié)的水體環(huán)境因子監(jiān)測結果見表1。根據(jù)中華人民共和國《海水水質標準(GB 3097-1997)》，所有采樣點水質均符合國家Ⅰ類海水標準。從表1 可以看出，所監(jiān)測水質指標均呈現(xiàn)顯著性季節(jié)差異。其中，水體鹽度在春季和冬季最高，夏季和秋季較低。從春季到冬季，水體溶解氧、總有機碳(TOC)、pH、硫化物和化學需氧量(COD)均表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，TN、NO2--N、PO43--P和TN 表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，氧化還原電位(ORP)、TP、NH4+-N 和NO3--N 則呈先升高后降低的趨勢。

表1 不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體環(huán)境因子Tab.1 Environmental factors of water in A. japonicus culture pond in different seasons

2.2 高通量測序結果

不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體樣品經檢測得到原始序列40540～71190 條，其中，有效序列33663～67711條，聚類于372～835 個OTUs。測序覆蓋率為95.94%～99.66%，表明測序結果真實反映樣本信息(表2)。

2.3 菌群多樣性

2.3.1 α 多樣性 遼寧長海刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群豐度和多樣性均呈顯著的季節(jié)性差異(表2)。根據(jù)菌群Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)可知，夏季水體菌群豐度最高，秋季水體菌群豐度最低，春季和冬季介于夏季和秋季之間。根據(jù)Shannon 和Simpson 指數(shù)可知，夏季水體菌群多樣性最高，秋季水體菌群多樣性最低，冬季略高于春季。

2.3.2 β 多樣性 在OTU 水平上，基于加權Unifrac距離對所有樣本進行三維坐標分析，結果見圖1。其中，第1 主坐標(PCoA1)的貢獻率為73.0%，第2 主坐標(PCoA2)的貢獻率為14.0%，第3 主坐標(PCoA3)的貢獻率為8.0%，三者累計貢獻率為95.0%。不同組別樣品分散于不同象限，表明池塘樣品組間菌群結構具有顯著差異。養(yǎng)殖池塘四季水體組內樣品大多聚集在一起，即顯示出較好的生物學重復。秋季水體菌群結構與其他3 個季節(jié)相比具有顯著差異(P＜0.05)，春季和冬季水體菌群相似性最高。

表2 高通量測序結果Tab.2 High throughput sequencing results

圖1 不同季節(jié)水體菌群Unifrac PCoA 圖Fig.1 Unifrac PCoA of water bacterial community in different seasons

2.4 優(yōu)勢菌群結構特征

不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構特征如圖2所示。從門水平上看，不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體優(yōu)勢菌門主要隸屬于變形菌門和擬桿菌門，二者相對豐度最高可達90%以上。其中，變形菌門在全年各季節(jié)均為第一優(yōu)勢菌門，相對豐度約占水體菌群的49.66%～70.02%。擬桿菌門均是不同季節(jié)的次優(yōu)勢菌門，春、夏、秋和冬的相對豐度分別為 27.35%、26.66%、23.33%和19.98%。

從屬水平上看，春季刺參養(yǎng)殖池塘水體主要優(yōu)勢菌屬為Planktomarina、Sulfitobacter、Litoreibacter、Loktanella、Amylibacter、Candidatus_Pelagibacter、Phaeocystidibacter、Olleya 和Polaribacter。夏季水體的主要優(yōu)勢菌屬隸屬于Planktomarina、Roseovarius、Litoreibacter、Candidatus_Pelagibacter 、 Vibrio 、 Halioglobus 、Phaeocystidibacter、Algibacter 和Pseudofulvibacter。秋季水體的主要優(yōu)勢菌屬隸屬于Pseudoalteromomas、Psychrobacter、Shewanella、Plaribacter、Olleya 和Bizionia。冬季水體的主要優(yōu)勢菌屬隸屬于Planktomarina、Sulfitobacter、Candidatus_Pelagibacter、Amylibacter和Polaribacter。優(yōu)勢菌屬組成存在顯著性季節(jié)差異(P＜0.05)。

2.5 差異菌群結構特征

屬水平下的水體菌群相似性分析結果表明，不同季節(jié)的遼寧長海刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群存在顯著性差異。其中，秋季與其他季節(jié)相比，共有菌群種類較少，相似性較低(圖3)。

LEfSe 分析結果顯示(圖4)，春、夏和冬季水體特異性菌門分別為疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門和厚壁菌門(Firmicutes)，秋季無特異性菌門。春季特異性菌屬主要隸屬于Planktomarina、Amylibacter和 Roseibacillus；夏季特異性菌屬主要隸屬于Owenweeksia、Phaeocystidibacter 和Euzebya；秋季特異性菌屬隸屬于Winogradskyella、Cryomorphaceae、Bizionia 和Psychrobacter；冬季特異性菌屬主要隸屬于Candidatus_Pelagibacter 和Sulfitobacter。

2.6 菌群功能特征

不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群功能預測結果見圖5。比對COGs 數(shù)據(jù)庫25 種功能蛋白，水體菌群中24 種功能蛋白存在顯著性差異(P＜0.05)。

春季和冬季水體菌群功能具有較高的相似性，表現(xiàn)為功能編碼[C,E,F,G,H,I,Q,P,M,N,O,T,U,V,G,J,M]的17 種功能蛋白顯著上調(P＜0.05)。其中，與代謝相關的全部功能均增強，具體表現(xiàn)在[C]能量的生產與轉換，[E]氨基酸的運輸和代謝，[F]核苷酸運輸與代謝，[G]碳水化合物運輸和代謝，[H]輔酶的運輸和代謝，[I]脂質轉運與代謝，[Q]次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝，[P]無機離子運輸與代謝方面。在細胞過程與信號傳導方面，菌群功能的增強體現(xiàn)在[M]細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生，[N]細胞的能動性，[O]翻譯后修飾、蛋白質轉換和伴侶蛋白，[T]信號傳導機制，[U]細胞內運輸、分泌和囊泡運輸，[V]防御機制。在信息存儲與處理方面，[K]轉錄與[L]復制、重組、修復相關功能蛋白顯著增強。

與春季相比，夏季水體菌群功能編碼[G,J,M]的功能蛋白顯著下調(P＜0.05)。具體表現(xiàn)為[G]碳水化合物運輸和代謝功能，[J]翻譯、核糖體結構，[M]生物發(fā)生功能、細胞壁/膜/包膜生物相關功能的下降。

秋季水體菌群功能編碼[D,Q,Z,W]的功能蛋白具有顯著性差異(P＜0.05)。在細胞過程與信號方面，表現(xiàn)為[D]細胞周期控制、細胞分裂、染色體分裂，[Z]細胞骨架功能的下降，以及[W]細胞外結構相關功能的升高。在新陳代謝方面，具體表現(xiàn)為[Q]次生代謝物的生物合成、轉運和分解代謝相關功能的下降。

3 討論

微生物作為養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，同時，作為生產者和分解者，保證了養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)中物質循環(huán)與能量供給，對維持生態(tài)系統(tǒng)平衡具有至關重要的作用(李博, 2013)。本研究利用高通量測序技術通過對刺參養(yǎng)殖池塘水體微生物16S rRNA 基因V3～V4片段進行擴增測序，全面鑒定水體微生物種類特征，深入解析水體微生物組成情況，以期為養(yǎng)殖水體環(huán)境菌群調控和刺參養(yǎng)殖疾病防治提供一定的理論基礎。

3.1 不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體優(yōu)勢菌群特征

圖2 不同季節(jié)水體菌群組成的相對豐度Fig.2 Relative abundance of water bacterial community in different seasons

圖3 屬水平下水體菌群network 圖Fig.3 Network diagram of water bacterial community in genus

本研究結果顯示，遼寧長海刺參養(yǎng)殖池塘水體不同季節(jié)優(yōu)勢菌門均為變形菌門和擬桿菌門，二者相對豐度之和最高可達90%以上，該結果與李建光等(2014)的研究報道相吻合。變形菌群作為第一優(yōu)勢菌門，主要是因為其在原核生物分子生物學分類或表型分類中占據(jù)了絕對的優(yōu)勢(Gupta, 2000)。擬桿菌門作為次優(yōu)勢菌門，是海洋浮游細菌的重要組成部分，其菌屬能夠產生胞外水解酶來降解生物大分子(如幾丁質、瓊脂等)(施云芬等, 2017)，同時，擬桿菌門還能在發(fā)酵碳水化合物的同時有效分解纖維細胞壁的多糖，常常與脂質蛋白質等有機物的代謝轉換有關，而這些有機物是水體碳循環(huán)的重要組成部分，在物質循環(huán)中具有重要作用(Chen et al, 2018)。

3.2 不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體差異菌群特征

比較不同季節(jié)的遼寧長海刺參養(yǎng)殖池塘水體差異菌群結構特征。結果顯示，春、夏和冬季具有顯著性差異的菌門分別隸屬于疣微菌門(16.01%)、放線菌門(11.67%)和厚壁菌門(2.01%)；秋季相比于其他季節(jié)沒有顯著的特異性菌群。不同季節(jié)特異性菌群的相對豐度與水體的理化因子的相對含量有關，理化因子含量的改變對水體菌群的生長和分布豐度具有一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)，水體理化因子為微生物生長和繁殖過程提供無機鹽和有機物等營養(yǎng)物質，菌群結構特征往往受其所處環(huán)境中理化因子濃度的影響(張麗娜等,2012; Nishiyama et al, 2018)。疣微菌門中的微生物廣泛存在于水生生態(tài)系統(tǒng)中，在生物地球的氮循環(huán)中起著重要作用(Bergen et al, 2014; Sharp et al, 2014; Shen et al, 2017)。本研究關于長海刺參養(yǎng)殖池塘不同季節(jié)水體所有監(jiān)測環(huán)境因子顯示，春季水體總氮含量在四季中最高。池塘生態(tài)系統(tǒng)為保持其穩(wěn)定性，春季水體疣微菌門相對豐度的增加在加快水體氮循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用。具有抗高溫特性的放線菌門作為夏季的差異菌門，在養(yǎng)殖池塘水體中具有降解淀粉、蛋白等大分子的功能，可以產生抗菌類物質，并能形成耐熱、耐干孢子等優(yōu)點，有成為益生菌的潛力(王蓉等,2013)。本研究結果顯示，環(huán)境溫度越低，水體厚壁菌門細菌相對豐度越大。這是因為厚壁菌門下的芽孢桿菌綱大部分微生物，能夠形成抗逆性極強的芽孢，從而具有極強的環(huán)境適應性(宋兆齊等, 2015)。此外，隸屬于厚壁菌門的枯草芽孢桿菌(Bacillus su btilis)可以降低養(yǎng)殖水體中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，能有效改善刺參養(yǎng)殖水體水質，提高機體消化酶和非特異性免疫酶活性，從而促進刺參生長(董春光等, 2015)，推測與冬季水體中檢測出較低含量的硝酸鹽和亞硝酸鹽有關。

圖4 不同季節(jié)水體菌群LEfSe 分析Fig.4 LEfSe analysis of water bacterial community in different seasons

圖5 基于COG 數(shù)據(jù)庫菌群功能注釋Fig.5 The function of bacterial community prediction based on COG database

3.3 不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群功能特征

通過比對COGs 數(shù)據(jù)庫25 種功能蛋白，刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群中24 種功能蛋白存在顯著性季節(jié)差異。春季和冬季水體菌群功能具有較高的相似性，但春季主要體現(xiàn)在新陳代謝等相關功能蛋白顯著增強(P＜0.05)；冬季主要表現(xiàn)在信息存儲與處理、細胞過程與信號相關功能蛋白顯著性增強(P＜0.05)。閆法軍(2013)研究發(fā)現(xiàn)，水體菌群功能存在季節(jié)性差異與不同季節(jié)特異性菌群有關。本研究中，春季特異性菌門為疣微菌門，其參與水體氮循環(huán)，加速蛋白質代謝功能(Freitas et al, 2012)，進而促使蛋白翻譯速度的增強，引起信息存儲于處理相關功能蛋白上調。冬季特異性菌門為厚壁菌門，其中代表性梭菌綱作為一種專性厭氧菌，具有很強的降解能力和代謝活性(宋景華等, 2013)，一定程度上可以解釋冬季水體菌群新陳代謝的增強。與春季和冬季相比，夏季的代謝、信息存儲與處理、細胞過程與信號相關功能蛋白顯著下降(P＜0.05)。放線菌門作為夏季的特異性菌群，產生的抗菌素種類與性質具有某些特性，能夠抑制池塘水體中其他革蘭氏陽性菌發(fā)揮功能(李文均等, 2002)，引起夏季水體菌群相關功能蛋白顯著下降。同時，放線菌能產生生物活性顯著的次生代謝產物，這種次生代謝產物是生命活動非必需的一類小分子有機化合物，這類有機化合物的增多，使生命活動必需的化合物相對含量降低(王淑霞等, 2007)，促使相關的功能蛋白顯著下降。

4 結論

本研究通過高通量測序技術揭示了遼寧長海刺參養(yǎng)殖池塘不同季節(jié)水體菌群結構與功能的特征。研究發(fā)現(xiàn)，隨著季節(jié)的變化，長海刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構和功能具有顯著演替過程。養(yǎng)殖池塘水體菌群豐度和多樣性的最高季節(jié)是夏季，最低季節(jié)是秋季。同時，水體菌群結構的季節(jié)性演替與其功能之間存在一定的相關性，但二者之間的相互作用機制還有待于進一步的深入探究。