張佳鳳，趙輝，何平，郝亞琳，董瓊娜，金曉杰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 耳鼻咽喉科，上海 201112

鼻咽癌是頭頸部的上皮性惡性腫瘤，在東南亞尤其是華南地區(qū)發(fā)病率較高[1]。鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是放療，同時(shí)進(jìn)行輔助化療[2-3]。然而，標(biāo)準(zhǔn)治療只有在早期治療鼻咽癌時(shí)才有效。當(dāng)疾病發(fā)展到晚期時(shí)，局部復(fù)發(fā)和化療耐藥是導(dǎo)致死亡的主要原因[4]。雖然鼻咽癌與人類(lèi)EBV感染密切相關(guān)，但研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境致癌物、誘導(dǎo)性遺傳因素以及AKT/mTOR通路等的異常激活，都會(huì)影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)化和發(fā)展[5]。因此，針對(duì)這些重要通路的治療策略將有利于更好地開(kāi)展鼻咽癌的臨床治療。

槲皮素是一種植物性黃酮苷類(lèi)化合物，被用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，并可預(yù)防癌癥等各種疾病的發(fā)生[6]。越來(lái)越多的研究揭示了槲皮素的生物和藥理活性，且發(fā)現(xiàn)其可選擇性抑制癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[7]。槲皮素可抑制膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種癌細(xì)胞增殖和遷移，發(fā)揮抑癌作用[8]。多項(xiàng)研究也在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡[9-10]。盡管已通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，但其具體的分子作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探索槲皮素對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖的影響，并進(jìn)一步用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)槲皮素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞中AKT/mTOR通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑：DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；槲皮素、胰蛋白酶、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA法蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Life公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。AKT和mTOR基因引物均由生工生物工程（上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。MTT和實(shí)驗(yàn)中所使用抗體（AKT多克隆抗體、mTOR多克隆抗體、β-actin單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗）以及RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.2 細(xì)胞與動(dòng)物：人鼻咽癌5-8F細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5%的CO2并且濕度完全飽和的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。6周齡左右且體質(zhì)量（25±2）g的雌性BALB/c小鼠10只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京)2016-0011。

1.2 方法

1.2.1 制備小鼠移植瘤模型：將對(duì)數(shù)期5-8F細(xì)胞濃度調(diào)整至5×107/mL，取0.3 mL細(xì)胞懸液在每只小鼠右后側(cè)肢體腋下行皮下注射，連續(xù)觀察1周后以腋下腫瘤結(jié)節(jié)形成且質(zhì)地較硬為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)：將100 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5-8F細(xì)胞（1×105/孔）接種于96 孔板中，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，共3組，加入不同濃度的槲皮素（20、40和 60 μmol/L）處理24 h、48 h和72 h后，MTT處理 4 h，使用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度，記下數(shù)值，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1-加藥組A570/空白組A570）×100%。

1.2.3 藥物處理和腫瘤大小觀察：成瘤小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和槲皮素組，每組5只。槲皮素組裸鼠腹腔注射25 mg/kg槲皮素，3次/周，每次0.2 mL，共4周，對(duì)照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，3次/周，共4周。每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，腫瘤體積=（長(zhǎng)徑×短徑2）/2。給藥4周后，頸椎脫臼法處死裸鼠，取腫瘤組織保存在液氮中。

1.2.4 熒光定量PCR：使用TRIzol試劑分離細(xì)胞RNA，測(cè)定濃度后采用反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)獲得cDNA。然后通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，以GAPDH作為對(duì)照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算AKT和mTOR基因mRNA含量。

1.2.5 Western blot：用預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞15 min，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，收取蛋白。腫瘤組織先在研缽中加入液氮進(jìn)行研磨，在研磨充分后加入細(xì)胞裂解液，離心后獲得腫瘤組織蛋白，所獲得蛋白經(jīng)BCA比色法計(jì)算蛋白濃度。通過(guò)SDS-PAGE電泳將蛋白進(jìn)行分離后先后使用一抗和二抗進(jìn)行孵育，然后進(jìn)行條帶的掃描。

1.2.6 免疫組織化學(xué)法：脫蠟及水化后的石蠟切片經(jīng)1%的Triton X-100處理15 min，再用3%的H2O2處理10 min，隨后加入AKT和mTOR抗體孵育，置于濕盒4 ℃過(guò)夜。第2天清洗后孵育對(duì)應(yīng)的二抗，室溫下30 min。最后進(jìn)行染色封片。染色結(jié)果采用DAB顯色法進(jìn)行觀察，使用蘇木精進(jìn)行對(duì)比染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度槲皮素對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖的影響 20、40、60 μmol/L槲皮素處理24、48和72 h均可顯著抑制5-8F細(xì)胞增殖，且槲皮素濃度越高，對(duì)細(xì)胞的抑制率越高（P＜0.05）。槲皮素抑制5-8F細(xì)胞增殖的作用呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。見(jiàn) 表1。

表1 槲皮素處理后鼻咽癌5-8F細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率（%）

2.2 槲皮素對(duì)5-8F細(xì)胞中AKT/mTOR通路表達(dá)的影響 5-8F細(xì)胞經(jīng)不同濃度槲皮素（20、40、 60 μmol/L）處理48 h后，隨著槲皮素濃度增加，AKT和mTOR的mRNA水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。Western blot檢測(cè)細(xì)胞中AKT和mTOR的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，在相同的處理時(shí)間內(nèi)（48 h），槲皮素濃度升高，AKT和mTOR的蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖1 5-8F細(xì)胞經(jīng)槲皮素處理后AKT和mTOR的mRNA水平

2.3 槲皮素對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響 所有裸鼠注射5-8F細(xì)胞1周后，進(jìn)食及活動(dòng)情況未見(jiàn)明顯變化，腫瘤表面皮膚無(wú)破潰發(fā)生。每周對(duì)裸鼠的體質(zhì)量和腫瘤體積進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示裸鼠的體質(zhì)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組相比，槲皮素處理組的腫瘤體積在第21天和第28天明顯受抑制 （P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 槲皮素抑制AKT和mTOR在體內(nèi)表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，槲皮素處理組中，AKT和mTOR蛋白水平顯著降低，與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，槲皮素處理組AKT和mTOR蛋白水平顯著低于對(duì)照組，見(jiàn)圖5。

3 討論

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，具有易復(fù)發(fā)、易早期轉(zhuǎn)移及惡性程度高等特點(diǎn)，是我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)頭頸部的惡性腫瘤[1-2]。目前，放療聯(lián)合化療仍是治療鼻咽癌的主要手段，其控制率可達(dá)80%以上[11]。然而，放療后的復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是臨床治療中面臨的兩大難題[12]。因此，尋求藥效強(qiáng)和不良反應(yīng)小的抗腫瘤藥物是目前鼻咽癌臨床治療中急需解決的問(wèn)題。

圖2 槲皮素對(duì)5-8F細(xì)胞中AKT和mTOR蛋白表達(dá)水平的影響

圖3 不同處理方式對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

圖4 Western blot檢測(cè)不同處理組裸鼠腫瘤組織AKT和mTOR蛋白水平

近年來(lái)，隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，篩選與挖掘活性天然產(chǎn)物已成為抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的重要來(lái) 源[13]。來(lái)源于中藥地榆的地榆皂苷對(duì)肝癌、乳腺 癌、人甲狀腺乳頭狀癌等多種腫瘤均表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤藥效[14]。ZHU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，地榆皂苷可激活乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的ROS/JNK信號(hào)通路，進(jìn)而加速乳腺癌細(xì)胞的凋亡。

槲皮素是一種天然的黃酮醇類(lèi)化合物，廣泛存在于水果、蔬菜及中草藥中，具有顯著的抗炎、抗腫瘤及清除自由基等功效[6]。大量研究表明，槲皮素可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外AMPK途徑、PI3K-AKT途徑和mTOR等多個(gè)信號(hào)通路，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[16-17]。SU等[18]研究表明，槲皮素可通過(guò)AMPK信號(hào)通路激活誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡。WARD等[19]研究結(jié)果也表明槲皮素可通過(guò)衰減細(xì)胞存活和抑制抗凋亡途徑抑制前列腺癌的發(fā)展。已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素也可通過(guò)抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞或HEN1細(xì)胞增殖從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)，或?qū)⒓?xì)胞周期阻滯于G2/M期和誘發(fā)胱天蛋白酶依賴(lài)的細(xì)胞凋亡[9-10]。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)槲皮素可顯著抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖，其抑制率與槲皮素濃度呈現(xiàn)正相關(guān)性，且通過(guò)裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，槲皮素對(duì)裸鼠鼻咽癌腫瘤體積有明顯的抑制作用。上述體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，槲皮素可能是治療鼻咽癌重要的潛在藥物。

圖5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同處理組裸鼠腫瘤組織AKT和mTOR蛋白水平

AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑之一，其與細(xì)胞的代謝、增殖、分化和凋亡等生理過(guò)程緊密相關(guān)[20]。AKT是AKT/mTOR信號(hào)通路中的一個(gè)重要激酶，可磷酸化p70S6K和4EBP1，而p70S6K和4EBP1是AKT/mTOR信號(hào)通路下游的主要靶點(diǎn)，可調(diào)控蛋白合成和細(xì)胞周期進(jìn)程。近年來(lái)，大量研究已證實(shí)，AKT/mTOR信號(hào)通路在各類(lèi)腫瘤的發(fā)病與治療中發(fā)揮了重要的作用。特別是與黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗腫瘤藥效作用發(fā)揮密切相關(guān)。JIA等[21]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素通過(guò)Akt/mTOR途徑抑制乳腺癌糖酵解與遷移，從而抑制乳腺癌的發(fā)展。此外，GRANATO 等[22]研究也表明槲皮素可通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)原發(fā)性積液性淋巴瘤細(xì)胞凋亡和自噬。WANG等[23]報(bào)道了AKT/mTOR信號(hào)通路的激活與鼻咽癌患者不良預(yù)后有關(guān)，而AKT/mTOR信號(hào)通路參與鼻咽癌細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、自噬、凋亡等過(guò)程[24-25]。本研究體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，槲皮素能顯著抑制AKT/mTOR信號(hào)通路中AKT和mTOR的mRNA和蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上述蛋白轉(zhuǎn)錄與翻譯水平與鼻咽癌的增殖水平密切相關(guān)。這表明，槲皮素可能通過(guò)調(diào)節(jié)AKT/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而抑制鼻咽癌的發(fā)展，但具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究初步探索了槲皮素抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，相關(guān)結(jié)果為活性天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。