張先元 陳強(qiáng) 章正祥 周會霞 邵敏峰 黃春華

不安腿綜合征（RLS）是一種嚴(yán)重影響生活的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，最典型的癥狀是有強(qiáng)烈活動雙腿的愿望，還常伴有肢體麻木、疼痛等不適感。目前認(rèn)為脊髓多巴胺能傳遞的減少可導(dǎo)致RLS［1］。臨床上使用多巴胺能拮抗劑可使病情加重，激動多巴胺D2受體（DRD2）、多巴胺D3受體（DRD3）可改善癥狀。研究發(fā)現(xiàn)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）和防御行為、疼痛密切相關(guān)［2-4］。本研究旨在探索RLS大鼠模型上PAG多巴胺D2受體的變化。

1 材料與方法

1.1 組織來源 雄性SD大鼠隨機(jī)分成空白組（n=3）、假手術(shù)組（n=6）、模型組（n=6）。對右側(cè)A11進(jìn)行藥物注射，第8天進(jìn)行行為學(xué)錄制和腦組織取材［5］。

1.2 主要試劑 小鼠抗大鼠TH單克隆抗體（T1299），Sigma-Aldrich；兔抗大鼠D2多克隆抗體（324393），Calbiochem；山羊抗兔IgG/HRP 聚合物（PV-6001），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物（PV-6002），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB（ZLI-9018），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 冰凍切片機(jī)（HM 550），德國美康儀器設(shè)備有限公司；數(shù)字切片掃描儀（Pannoramic MIDI II），3DHISTECH。

1.4 免疫組化 （1）切片制備：根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》（第6版）分別對A11、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）進(jìn)行定位。在-20℃的恒溫箱中連續(xù)切片，A11厚度為30 μm，每隔5張取1張，共6套，每套12～15張，PAG厚度40 μm，隔3張取1張，取3張切片，收集于0.01M PBS液中，于4℃保存。（2）免疫組化漂片法：吸干PBS液，3% H2O2室溫孵育15 min；PBS液搖床漂洗3 min，共3次；加入含有0.3% Triton X-100的PBST液孵育30 min；吸干PBST液，加一抗，4 ℃孵育過夜；PBS液搖床漂洗10 min，共3次；加入二抗聚合物，37℃孵育20 min；PBS液搖床漂洗10 min，共3次；DAB溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，避光顯色5～10 min；PBS液搖床漂洗5 min，共3次；貼片，37 ℃烘干；85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇梯度脫水各2 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各透明2 min；中性樹膠封片。A11加小鼠抗大鼠TH單克隆抗體（1∶2000）和山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物，PAG加兔抗大鼠D2多克隆抗體（1∶4000）和山羊抗兔IgG/HRP 聚合物。

1.5 圖片分析 （1）每只大鼠取第一和第四套A11切片進(jìn)行染色。所有A11切片在同一物鏡（×4）下用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行照片采集。剔除只含黑質(zhì)、A13等部位的切片，每套最終取6張含A11部位的切片（以mt、fr及第三腦室等為參考標(biāo)志），人工計數(shù)A11部位表達(dá)TH多巴胺神經(jīng)元的數(shù)目，并分左右進(jìn)行統(tǒng)計。（2）利用數(shù)字切片掃描儀對組織切片進(jìn)行數(shù)字化掃描，以《大鼠腦立體定位圖譜》第6版為參考，對導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)外側(cè)（LPAG）放大40倍后選取一張圖像進(jìn)行分析。人工計數(shù)多巴胺D2受體陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量，并分左右進(jìn)行統(tǒng)計。單側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元數(shù)量=12張切片同側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元數(shù)量之和，毀損率=1-單側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元數(shù)量/空白組同側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元數(shù)量的均值，毀損率若為負(fù)數(shù)，則記為0，如果毀損組毀損率＜20%，假手術(shù)組≥20%，則予以剔除。其中1個假手術(shù)組樣本碎裂，1個假手術(shù)組樣本右側(cè)A11毀損率＞20%（同批次動物本研究團(tuán)隊(duì)行A11毀損率檢測，大部分假手術(shù)組右側(cè)A11毀損率＜20%），兩個樣本均予以剔除，剩余13個樣本。模型組、假手術(shù)組各取3個樣本，與空白組匹配。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，方差齊者采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊者采用Games-Howell統(tǒng)計法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)及A11毀損結(jié)果 毀損組右側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元?dú)p率明顯高于對側(cè)和假手術(shù)組右側(cè)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明A11毀損是成功的，并且毀損一側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元的同時還會引起對側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元的減少。毀損組第3 h的爬籠時間高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而其余時間段和指標(biāo)均無明顯差異，表明在11∶00-12∶00時間段，毀損組的運(yùn)動活性有所增高。

2.2 多巴胺D2受體陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量及比較 LPAG左側(cè)及右側(cè)中多巴胺D2受體陽性細(xì)胞組間均有明顯差異。見表1。免疫組化結(jié)果見圖1、2。

表1 LPAG中多巴胺D2受體陽性細(xì)胞數(shù)量的比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

指標(biāo)部位 組別 n LPAG右側(cè) 左側(cè)DRD2 模型組 3 42.00±1.33 42.67±2.19假手術(shù)組 3 26.89±0.69# 26.78±0.51#正常組 3 33.33±7.94 33.11±6.29*F值 7.930 12.902 P值 0.021 0.007

圖1 -1空白組LPAG左側(cè)DRD2（×40）

圖1 -2假手術(shù)組LPAG左側(cè)DRD2（×40）

圖1 -3模型組LPAG左側(cè)DRD2（×40）

圖2 -1空白組LPAG右側(cè)DRD2（×40）

圖2 -2假手術(shù)組LPAG右側(cè)DRD2（×40）

圖2 -3模型組LPAG右側(cè)DRD2（×40）

3 討論

A11核團(tuán)從PAG最前端開始延伸至下丘腦背側(cè)尾側(cè)，內(nèi)側(cè)延伸至乳頭丘腦束［6］，是A8-A16多巴胺能細(xì)胞群中唯一對脊髓進(jìn)行神經(jīng)支配的核團(tuán)［1］，通過毀損A11核團(tuán)可制備 RLS模型［7］。

有學(xué)者認(rèn)為動物的防御行為和DMPAG、DLPAG、LPAG有關(guān)［2］，若興奮尾側(cè)的LPAG可引起以肢體肌肉劇烈活動為主要特征的逃跑反應(yīng)［3］。DRD2可對運(yùn)動活性、疼痛產(chǎn)生影響［8］。對A11進(jìn)行電刺激，可通過三叉神經(jīng)頸復(fù)合體上的DRD2抑制疼痛信息，對A11毀損后，在三叉神經(jīng)頸復(fù)合體上可見共同表達(dá)DRD2和5-HT1B/1D受體［9］，本課題組發(fā)現(xiàn)A11毀損后這兩種受體同時也存在PAG上［5］。PAG可能是內(nèi)源性疼痛調(diào)節(jié)的最重要部位［4］，PAG傳遞的感覺信號受到多巴胺D1和D2樣受體的調(diào)節(jié)［10］。

多巴胺受體對多巴胺進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)突觸中多巴胺含量減少時可激活突觸前膜D2自身受體，進(jìn)而導(dǎo)致軸突末端多巴胺濃度增加［11］。動物研究表明D2受體拮抗劑或多巴胺濃度降低可以上調(diào)D2受體表達(dá)，而D2受體激動劑的慢性刺激可降低受體濃度，RLS病人D2受體密度增加可能與多巴胺能神經(jīng)傳遞功能減退后引起受體表達(dá)上調(diào)有關(guān)［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)RLS模型組大鼠雙側(cè)LPAG中多巴胺D2受體明顯增高，可能也是毀損A11后導(dǎo)致多巴胺合成減少進(jìn)而引起多巴胺D2受體表達(dá)上調(diào)，LPAG雙側(cè)都受影響可能的原因：（1）毀損一側(cè)A11后引起對側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元減少，影響到雙側(cè)A11多巴胺下行通路。（2）三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核是三叉神經(jīng)頸復(fù)合體重要組成部分，A11對三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核進(jìn)行雙側(cè)投射［13］，而LPAG接受三叉神經(jīng)脊束核的神經(jīng)投射［2］。本研究仍有較多不足，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究A11多巴胺神經(jīng)具體如何下行。