徐玉紅 張慧雅 鄭偉平 盧琪蕓 阮雅文 陳君霞

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤，在女性癌癥相關(guān)死亡中占5%～6%。每年卵巢癌的全球新發(fā)病例超過23萬，且有≥14萬女性因卵巢癌死亡［1］。盡管手術(shù)及化療被廣泛應(yīng)用于卵巢癌治療，80%的患者發(fā)展為化療耐藥并轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致死亡［2］。研究表明，多種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在卵巢癌中表達(dá)失調(diào)，可作為卵巢癌的潛在治療靶點(diǎn)［3-5］。前列腺癌相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1（PCAT-1）是近幾年才被發(fā)現(xiàn)的人類癌癥相關(guān)分子，在多種腫瘤疾病中被證實(shí)具有致癌作用［6-8］。本研究旨在探討PCAT-1在卵巢癌組織中的表達(dá)及抑制PCAT-1表達(dá)對(duì)卵巢癌惡性生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）標(biāo)本與細(xì)胞株：收集2019年6月至2020年9月本院手術(shù)切除的卵巢癌組織20例，同時(shí)取癌旁正常組織20例，立即置于液氮保存，所有患者術(shù)前未進(jìn)行任何輔助治療，術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)。該研究項(xiàng)目獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，所有患者均于術(shù)前簽署知情同意書。人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。（2）主要試劑：胎牛血清，McCoy's 5A培養(yǎng)基，胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。TRIzol試劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。引物序列、小干擾RNA（si-RNA）均由上海吉瑪制藥公司設(shè)計(jì)合成。CCK-8購(gòu)自MCE（MedChemExpress）公司，Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司，蛋白提取試劑RIPA及蛋白酶抑制劑購(gòu)自碧云天公司，PARP1及β-actin一抗購(gòu)自santa cruz公司。

1.2 方法 （1）熒光實(shí)時(shí)定量PCR：利用TRIzol試劑提取卵巢癌組織樣本中的RNA，取1 μg的總RNA利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qPCR。PCAT-1的引物序列上游5'-GACAAACCGCAACATCACCA-3'，下游 5'-GCTCCTCATCTTCAAGGCTCT-3'，GADPH 的引物序列上游5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，下游 5'- AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。以GADPH為內(nèi)參基因，采用2-△△ct法計(jì)算PCAT-1的相對(duì)表達(dá)量。（2）細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：細(xì)胞置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中，在含10%胎牛血清和1%雙抗的McCoy's 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔1～2天更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%時(shí)，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行小干擾RNA轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染si-PCAT-1和陰性對(duì)照si-NC，轉(zhuǎn)染時(shí)為無血清培養(yǎng)液，6 h后換成含10%FBS的新鮮培養(yǎng)液。si-PCAT-1序列上游5'-GCUGAUCAUCUUACAACUATT-3'，下游 5'-UAGUUGUAAGAUGAUCAGCTT-3'，si-NC 序列上游5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3'，下游5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'。采用RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，方法同1.2.1。（3）CCK-8法：將兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×103/孔鋪于96孔板，于接種培養(yǎng)第6 h、24 h、48 h、72 h加入10 μl/孔CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。（4）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取接種于6孔板中的兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（融合度約90%），用200 μl滅菌槍頭垂直劃線，顯微鏡下測(cè)量劃痕的初始距離，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h、48 h和72 h后，測(cè)量劃痕距離，并計(jì)算細(xì)胞的遷移率。細(xì)胞遷移率=［遷移距離（0 h）-遷移距離（24 h、48 h、72 h）］/遷移距離（0 h）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。（5）Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel基質(zhì)膠與5A培養(yǎng)液以1∶8比例稀釋后混勻，加入到Transwell小室上室的底部膜上，放入培養(yǎng)箱中6 h以充分凝固。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，選擇無血清培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸調(diào)整密度為5×104/ml，取200 μl/孔加Transwell入培養(yǎng)板上室，將含10%血清的培養(yǎng)液以500 μl/孔加入Transwell培養(yǎng)板下室，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦拭Transwell培養(yǎng)板上室中未穿過基底膜的SKOV3細(xì)胞，甲醇固定20 min，PBS清洗3次，0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，PBS清洗3次。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算穿過基底膜的SKOV3細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。（6）western blot：將轉(zhuǎn)染后的兩組SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞并用RIPA裂解，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。用SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)PVDF膜，將膜放入5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h，加入一抗PARP1（1∶1000）、β-actin（1∶1000）4 ℃過夜孵育，TBST洗膜后加入酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h，洗膜后加入發(fā)光液于凝膠成像系統(tǒng)中顯影拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCAT-1在卵巢癌組織中的表達(dá) PCAT-1在卵巢癌組織中的表達(dá)量（3.66±0.47）高于癌旁組織（1.35±0.24），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.42，P＜0.01），見圖1。

圖1 PCAT-1在卵巢癌及正常癌旁組織中的表達(dá)

2.2 下調(diào)PCAT-1表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-PCAT-1和si-NC48 h后，si-PCAT-1組的PCAT-1表達(dá)量（0.23±0.03）顯著低于si-NC組（1.00±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.82，P＜0.01），見圖2A。下調(diào)PCAT-1表達(dá)后，si-PCAT-1組48 h、72 h細(xì)胞增殖活性（0.92±0.05、1.56±0.08）較si-NC組（1.29±0.07、1.86±0.06）下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.32、t=6.68，P均 ＜0.01），見圖2B。

圖2 PCAT-1干擾效果及下調(diào)PCAT-1表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 下調(diào)PCAT-1表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)表明，與si-NC組（0.87±0.05）相比，si-PCAT-1組（0.72±0.05）的細(xì)胞遷移率在72小時(shí)后降低（t=3.9，P＜0.05），見圖3。transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，si-PCAT-1組（68.40±12.28）穿過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯少于si-NC組（138.00±10.70），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.56，P＜0.01），見圖4。

2.4 下調(diào)PCAT-1表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞PARP1蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果表明，si-PCAT-1組（0.41±0.07）PARP1蛋白表達(dá)水平較si-NC組（0.71±0.04）降低，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.51，P＜0.01），見圖5。

圖3 下調(diào)PCAT-1表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移襲能力的影響

圖4 下調(diào)PCAT-1表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響

圖5 下調(diào)PCAT-1表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞PARP1蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

PCAT-1長(zhǎng)約1.9 kb，由兩個(gè)外顯子構(gòu)成，位于染色體8q24，原癌基因MYC上游725 kb處。最初是在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量升高促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展并惡化。之后，PCAT-1被證實(shí)在多種癌癥疾病中表達(dá)異常，通過影響細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡、細(xì)胞周期、同源重組等發(fā)揮致癌作用［9］。研究表明，PCAT1與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)，可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖，遷移，侵襲及上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），骨肉瘤細(xì)胞中抑制PCAT-1使得停留在細(xì)胞周期G0/G1期的細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少［10］。在直腸癌相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PCAT-1顯著抑制了細(xì)胞增殖，并誘發(fā)細(xì)胞周期捕獲［11］。此外，PCAT-1還參與腫瘤化療耐藥。抑制PCAT-1表達(dá)可通過p38和MAPK信號(hào)通路抑制多發(fā)性骨髓瘤硼替佐米耐藥［12］。PTEN是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，調(diào)控著細(xì)胞周期和多種信號(hào)途徑，LI等［13］研究表明，PCAT-1可通過抑制PTEN促進(jìn)胃癌順鉑化療耐藥。關(guān)于PCAT-1在卵巢癌中的表達(dá)及其相關(guān)分子機(jī)制，目前報(bào)道的文獻(xiàn)較少。LIU等［14］研究表明，PCAT-1在卵巢癌組織中表達(dá)較癌旁組織升高，可能是通過下調(diào)抑癌基因KLF-6（kruppel like factor 6）參與卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過程。本研究通過檢測(cè)20例卵巢癌和癌旁組織發(fā)現(xiàn)，PCAT-1在卵巢癌組織中高表達(dá)，且抑制PCAT-1表達(dá)后卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力下降，說明PCAT-1在卵巢癌中存在致癌作用，可能通過調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為影響卵巢癌的進(jìn)展。

PARP抑制劑作為卵巢癌患者化療后的維持治療藥物，廣泛應(yīng)用于臨床，可明顯延長(zhǎng)BRCA突變的鉑敏感復(fù)發(fā)性高級(jí)別卵巢癌患者無進(jìn)展生存期［15］。最新研究結(jié)果證實(shí)［16］，新診斷的攜帶BRCA1/2突變的高級(jí)別卵巢癌患者也可獲益，與安慰組相比，PARP抑制劑維持治療組疾病進(jìn)展或者死亡風(fēng)險(xiǎn)降低70%。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為，PCAT-1對(duì)PARP存在調(diào)控行為。在結(jié)腸癌細(xì)胞株中HT-29及Caco-2研究發(fā)現(xiàn)，抑制PCAT-1表達(dá)可致caspase-3、bax、PARP等清除率增加，并抑制了癌基因bcl-2表達(dá)［15］。此外，體內(nèi)外研究結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，PCAT-1可通過抑制BRCA2表達(dá)調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞對(duì)PARP1抑制劑的敏感性［17］，提示PCAT-1可能在PARP1抑制劑靶向治療前列腺癌等腫瘤性疾病中具有輔助作用。關(guān)于卵巢癌細(xì)胞中PCAT-1對(duì)PARP1的調(diào)控作用目前尚未明確。本研究結(jié)果表明，抑制SKOV3細(xì)胞中PCAT-1表達(dá)后，PARP1蛋白表達(dá)水平下降，提示卵巢癌細(xì)胞中PCAT-1可能對(duì)PARP1存在著調(diào)控作用，但其具體的調(diào)控分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。