徐華軍

摘 要：為驗證Pall Supor EBV過濾器（0.2 μm過濾精度）用于20%人血白蛋白注射劑達到除菌過濾的目的，在少量工藝流體中接種缺陷假單胞菌（B. diminuta）ATCC 19146TM后加入循環(huán)的20%人血白蛋白注射劑中。挑戰(zhàn)溶液在最差工藝條件下通過待測過濾器，挑戰(zhàn)水平應(yīng)≥1.0×107 CFU/cm2有效過濾面積（CFU為菌落形成單位），分析濾出液是否含有缺陷假單胞菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濾出液不含有缺陷假單胞菌。得出的結(jié)論為：Pall Supor EBV過濾器（0.2 μm過濾精度）適用于20%人血白蛋白注射劑的除菌過濾。

關(guān)鍵詞：人血白蛋白;EBV過濾器;除菌過濾;驗證

20%人血白蛋白注射劑是非最終滅菌的無菌生物制品，其中最終灌裝生產(chǎn)工藝需要使用0.2 μm過濾精度的除菌過濾器進行除菌過濾，以達到無菌的質(zhì)量標準。本次試驗采用的方法是：少量工藝流體中接種缺陷假單胞菌（Brevundimonas diminuta，B. diminuta）ATCC 19146TM后加入循環(huán)的20%人血白蛋白注射劑中。挑戰(zhàn)溶液在最差工藝條件下通過待測過濾器，挑戰(zhàn)水平應(yīng)≥1.0×107 CFU/cm2有效過濾面積（CFU為菌落形成單位），分析濾出液是否含有缺陷假單胞菌。本試驗旨在驗證Pall Supor EBV過濾器 ? （0.2 μm過濾精度）用于20%人血白蛋白注射劑的除菌過濾效果。

1 ? ?材料和方法

1.1 ?材料與儀器

1.1.1 ?材料

白蛋白注射液（質(zhì)量分數(shù)為20%，廣西冠峰生物制品有限公司），缺陷假單胞菌（B. diminuta）ATCC 19146TM ? （PW 081815，美國菌種保藏中心）。

1.1.2 ?主要儀器

除菌過濾器：0.2 μm過濾精度的Supor EBV濾膜（FTKEBV，美國Pall公司），0.45 μm過濾精度的Supor 450濾膜（型號60173，美國Pall公司）。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?微生物準備和挑戰(zhàn)用菌懸液

缺陷假單胞菌事先通過大規(guī)模培養(yǎng)至穩(wěn)定期，菌體 （PW 081815）以冷凍狀態(tài)保存，使用前制備成挑戰(zhàn)用菌懸液。由于工藝流體對缺陷假單胞菌具有非殺菌性作用，將缺陷假單胞菌以3.1×107 CFU/mL的細菌濃度懸浮于少量的20%人血白蛋白注射劑中，然后加入循環(huán)的20%人血白蛋白注射劑中（約0.5 mL/min）挑戰(zhàn)300 min，以達到適宜的挑戰(zhàn)濃度。

1.2.2 ?儀器準備

（1）采用Pall進行挑戰(zhàn)。待測濾膜與工藝過濾器（ABIEBV7PH4）所含的濾膜具有相同材質(zhì)，在125 ℃下高壓滅菌60 min。然后將濾膜安裝在適當?shù)倪^濾器夾持器中，有效過濾面積為13.8 cm2。每個夾持器安裝一個待測濾膜或?qū)φ諡V膜。為確認濾膜的過濾精度及完整性，使用前對每個過濾器進行泡點測試。

（2）為了確認缺陷假單胞菌的單分散性以及是否能夠透過0.45 μm過濾精度濾膜，用Pall 0.45 μm過濾精度的Supor 450濾膜（60173）作為對照。

（3）用一定量的菌懸液挑戰(zhàn)待測過濾器，每個過濾器的最終挑戰(zhàn)水平應(yīng)大于1.0×107 CFU/cm2有效過濾面積。將接種后的工藝流體逐漸加入循環(huán)通過待測和對照過濾器的工藝流體中。

（4）挑戰(zhàn)試驗操作參數(shù)。驗證的首要目的是證明20%人血白蛋白注射劑在模擬實際生產(chǎn)工藝的挑戰(zhàn)條件下不會影響Pall 0.2 μm過濾精度的Supor EBV濾膜對缺陷假單胞菌的完全截留[1]。為達到該目的，在模擬最惡劣工藝參數(shù)的試驗條件下，將工藝流體循環(huán)通過待測過濾器和對照過濾器，同時將缺陷假單胞菌懸浮在少量工藝流體中，以大約0.5 mL/min的速度加入循環(huán)系統(tǒng)。

（5）在裝有待測濾膜的夾持器下游，無菌連接一個裝有Pall 0.2 μm過濾精度的Supor 200截留濾膜（66549）的夾持器。

（6）用懸浮于無菌20%人血白蛋白注射劑中的缺陷假單胞菌進行挑戰(zhàn)。通過待測過濾器上下游的壓力表來監(jiān)測壓差。挑戰(zhàn)結(jié)束后，用3 000 mL無菌水沖洗截留過濾器，然后取出截留濾膜，置于大豆胰酶瓊脂（TSA）平板上培養(yǎng)。

（7）挑戰(zhàn)前和挑戰(zhàn)后分別從菌懸液中取樣檢測活菌濃度，采用最低的菌濃度計算挑戰(zhàn)濃度。

（8）平板均在（30±2）℃下培養(yǎng)至少7天。挑戰(zhàn)后需對待測過濾器進行泡點測試。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ?工藝和試驗參數(shù)

根據(jù)生產(chǎn)工藝，挑戰(zhàn)試驗在15～16 psi（0.10～0.11 MPa）下維持122 min、在29.0～30.5 psi（0.20～0.21 MPa）下維持10 min，其余時間低速循環(huán)，壓差維持在7～9 psi（0.05～0.06 MPa）。

2.2 ?挑戰(zhàn)前后的完整性測試數(shù)據(jù)

挑戰(zhàn)前后的完整性測試數(shù)據(jù)如表1所示。

2.3 ?缺陷假單胞菌挑戰(zhàn)用量

缺陷假單胞菌挑戰(zhàn)用量如表2所示。

總挑戰(zhàn)菌數(shù)（CFU）=較低的挑戰(zhàn)菌濃度（CFU/mL）×菌懸液用量（mL）（1）

挑戰(zhàn)濃度（CFU/mL）=總挑戰(zhàn)菌數(shù)（CFU）/總批量（mL）（2）

2.4 ?待測過濾器和對照過濾器的挑戰(zhàn)參數(shù)及細菌截留數(shù)據(jù)

待測過濾器和對照過濾器的挑戰(zhàn)參數(shù)及細菌截留數(shù)據(jù)如表3所示。

總挑戰(zhàn)菌數(shù)（CFU）=挑戰(zhàn)濃度（CFU/mL）×批量（mL）（3）

挑戰(zhàn)水平（CFU/cm2）=總挑戰(zhàn)菌數(shù)（CFU）/有效過濾面積（EFA）（4）

截留量=總挑戰(zhàn)菌數(shù)/總透過菌數(shù)（5）

Pall 0.2 μm過濾精度的Supor EBV除菌級濾膜（FTKEBV）截留了100%的挑戰(zhàn)用微生物，表明在本研究所述的最惡劣試驗條件下，該類濾膜可以完全截留缺陷假單胞菌。作為對照，0.45 μm過濾精度的Pall Supor 450對照濾膜（60173）允許缺陷假單胞菌透過到濾出液中，符合細菌截留試驗的接受標準。

2.5 ?細菌挑戰(zhàn)結(jié)果

在細菌挑戰(zhàn)階段，壓差變化范圍在7.0～30.5 psi，流速變化范圍在10～54 mL/min。

2.6 ?接受標準

驗證試驗符合所有接受標準，如表4所示。

3 ? ?結(jié)語

Pall 0.2 μm過濾精度的Supor EBV除菌級過濾器可完全截留懸浮于20%人血白蛋白注射劑中的缺陷假單胞菌，挑戰(zhàn)水平不低于8.7×107 CFU/cm2有效過濾面積。用20%人血白蛋白注射劑模擬生產(chǎn)工藝中的壓差、時間和批量進行細菌挑戰(zhàn)。根據(jù)試驗結(jié)果，Pall Supor EBV除菌級過濾器在本試驗所述的參數(shù)下，適用于20%人血白蛋白注射劑的除菌過濾。

[參考文獻]

[1]MARTIN J.PDA technical report No.26“Sterilizing Filtration of Liquids”[EB/OL].（2007-06-13）[2021-02-20].https：//www.docin.com/p-566612727.html.