張思敏，梁躍，蘇梅清，潘艷坤，江燕，黃艷洪，黃璐璐

（廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，南寧 530022）

丁醚脲屬硫脲類殺蟲、殺螨劑，主要用于棉花、果樹、蔬菜、觀賞植物、大豆等作物防治各種螨類、粉虱、小菜蛾、菜青蟲、蚜蟲、葉蟬、潛葉蛾、蚧等害蟲、害螨［1］；氟吡菌胺對霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病等常見卵菌綱病害具有杰出防治效果［2–3］；氟唑菌酰胺是近幾年發(fā)展起來用于防治廣譜真菌病害的羧酰胺類殺菌劑，具有較好的預(yù)防、治療活性作用，可防治近百種作物中至少26 種真菌病害［4］；螺蟲乙酯是季酮酸類化合物，是迄今具有雙向內(nèi)吸傳導(dǎo)性能的現(xiàn)代殺蟲劑之一，高效廣譜，持效期長，有效防治期可達(dá)8 周［5］。GB 2763–2019 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》收錄了上述4 種農(nóng)藥［6］，并規(guī)定了在相關(guān)農(nóng)作物中的最大允許殘留限量，但標(biāo)準(zhǔn)中并沒有指定或推薦檢測方法。目前上述4 種農(nóng)藥的檢測方法缺乏相關(guān)現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。QuEChERS 原則具有快速、簡單、廉價(jià)、有效、可靠、安全的特點(diǎn)，是近年來得到廣泛應(yīng)用的食品農(nóng)殘樣品前處理技術(shù)之一［7］，可極大縮短樣品處理時(shí)間，適用于大批量樣品的處理。國內(nèi)較多項(xiàng)目采用QuEChERS 原則處理樣品，以液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法對樣品中的殺蟲劑、殺菌劑等進(jìn)行分析［8–12］，但目前尚未發(fā)現(xiàn)同時(shí)測定果蔬中丁醚脲、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯4 種農(nóng)藥的相關(guān)報(bào)道。筆者采用乙腈作為提取液，以QuEChERS 原則凈化樣品，用外標(biāo)法定量，建立了高效液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測定蔬菜水果中的丁醚脲、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯殘留量。該法對日常食品農(nóng)藥殘留檢測工作具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

三重四級桿高效液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀：TSQ Quantum Access Max 型，配有電噴霧離子源（ESI），賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

渦旋混合儀：VORTEX MIXER 型，美國Labnet公司。

高速離心機(jī)：TDL–40B 型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

氮吹儀：TTL–DC Ⅱ型，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司。

電子天平：AE240 型，感量為0.1 mg，梅特勒–托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

CNW dSPE 基質(zhì)分散固相萃取純化管：150 mg MgSO4，50 mg PSA，2 mL／(100 pcs)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

針筒式濾膜過濾器：0.45 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

乙腈、甲醇：均為色譜純，4 L，德國默克公司。

丁醚脲標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.9%，0.1 g／瓶，編號為80060–09–9，德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.9%，0.1 g／瓶，編號為239110–15–7，德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

氟唑菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度為98.2%，0.1 g／瓶，編號為DRE–C13875000，德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.2%，0.1 g／瓶，編號為203313–25–1，德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

氯化鈉、乙酸胺、甲酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，符合GB／T 6682–2008 一級水標(biāo)準(zhǔn)要求。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold 柱（150 mm×2.1 mm，5 μm，英國Hypersil 公司）；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流動相：5 mmol／L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）–乙腈，流量為0.2 mL／min，梯度洗脫程序如表1 所示。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源：正離子掃描模式（ESI）；監(jiān)測模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；噴霧電壓：3 500 V；離子傳輸毛細(xì)管溫度：350 ℃；蒸發(fā)溫度：100 ℃；鞘氣壓力：3.67 kPa；輔助氣流量：5 L／min；4 種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)如表2 所示。

表2 4 種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品處理

分別選取柑橘和菜心作為試驗(yàn)樣品，取樣部位按照GB 2763–2019 附錄A 執(zhí)行，切碎，充分混勻，采用四分法取樣或直接放入組織搗碎機(jī)中搗碎至勻漿，再放入聚乙烯瓶中［6］。將制備好的試驗(yàn)樣品均分為兩份，分別裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并做標(biāo)記，于–18 ℃冷凍保存。

稱取2 g 試樣（精確至0.01 g），置于15 mL 離心管中，加入5.00 mL 乙腈、1 g 氯化鈉渦旋混勻1 min，然后超聲波提取30 min，于離心機(jī)上以3 500 r／min 轉(zhuǎn)速離心3 min，吸取上清液約2 mL 移至dSPE 純化管中，渦旋混勻1 min，以3 500 r／min 轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取上清液過0.45 μm 濾膜，待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：100 μg／mL，分別準(zhǔn)確稱取10 mg 丁醚脲、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)品于4 只100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標(biāo)線。保存于–18℃冰箱內(nèi)，6 個(gè)月內(nèi)使用。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：1 μg／mL，分別準(zhǔn)確吸取0.10 mL 丁醚脲、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于1 只10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標(biāo)線。保存于4℃冰箱內(nèi)，1 周內(nèi)使用。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確稱取6 份2 g(精確至0.01 g)未檢出待測農(nóng)藥的空白試驗(yàn)樣品于15 mL 離心管中，按1.3.1 方法處理，得到空白樣品基質(zhì)溶液，用該空白基質(zhì)溶液配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取試劑的選擇

選用空白柑橘樣品，加入4 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，使加標(biāo)水平均為50 μg／kg，分別考察乙腈、乙酸乙酯兩種常用農(nóng)殘?zhí)崛≡噭? 種農(nóng)藥的提取效果，結(jié)果見表3。由表3 可知，采用乙腈作為提取試劑時(shí)4種農(nóng)藥的回收率均符合要求，且優(yōu)于乙酸乙酯作為提取劑時(shí)的回收率，因此選擇乙腈作為提取試劑。

表3 不同提取劑下4 種農(nóng)藥的回收率

2.2 凈化方法的選擇

在檢測果蔬等植物性樣品中農(nóng)藥殘留時(shí)，提取液中的雜質(zhì)可能會給質(zhì)譜檢測帶來基質(zhì)干擾，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般常用的凈化方法有液–液萃取法、固相萃?。⊿PE）凈化法、QuEch-ERS 原則凈化法。其中傳統(tǒng)的液–液萃取法凈化效果有限，已逐漸被淘汰；氨基柱SPE 法則是目前較為常用的多農(nóng)殘檢測凈化方法，其在多農(nóng)殘檢測的國標(biāo)方法GB／T 20769–2008、GB 23200.8–2016中均被使用，該法凈化效果較好，但操作繁瑣，有機(jī)試劑消耗大。相比之下，QuEchERS 原則凈化方法則具有快速、簡便、廉價(jià)、有效、安全等特點(diǎn)，近年來多被應(yīng)用于植物性食品中的農(nóng)殘檢測中。分別考察QuEchERS 原則凈化法和氨基柱固相萃取凈化法對丁醚脲、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯4 種農(nóng)藥的凈化效果。加標(biāo)的樣品經(jīng)乙腈提取后，分別采用QuEchERS 原則凈化法（按1.3.1 步驟）和氨基柱固相萃取法（按GB／T 20769–2008 要求）進(jìn)行凈化處理并測定。結(jié)果表明，QuEchERS 原則凈化法和氨基柱SPE 凈化法對4 種農(nóng)藥的回收率均可達(dá)到70%以上，由于QuEchERS 原則凈化法較氨基柱SPE 凈化法操作更為簡單、快速，且消耗有機(jī)試劑更少，因此采用QuEchERS 原則凈化法。

2.3 儀器參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 色譜條件

選用Hypersil Gold 柱進(jìn)行分離［13–15］，4 種待測農(nóng)藥均有較好的分離效果。在水–乙腈體系中，氟吡菌胺、氟唑菌酰胺出峰較快，且不易分開，易產(chǎn)生雜質(zhì)干擾，無法準(zhǔn)確定量；采用乙酸銨–乙腈體系，以5 mmol／L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）–乙腈作為流動相，并按照表1 的梯度洗脫程序進(jìn)行檢測，4種待測農(nóng)藥均得到了較好的分離效果，滿足質(zhì)譜定性定量檢測的要求。流動相中少量甲酸的加入有效提高了待測農(nóng)藥的質(zhì)譜響應(yīng)值和檢測靈敏度。4 種待測農(nóng)藥的空白柑橘基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)的選擇離子色譜圖（SRM）見圖1。

圖1 4 種待測農(nóng)藥空白柑橘基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)的選擇離子色譜圖

2.3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)丁醚脲、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯4 種待測農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)特性，采用ESI 電離源、正離子掃描，選擇離子反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式進(jìn)行定性定量測定。采用質(zhì)譜工作站軟件TSQ Tune 分別對4 種待測農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)的自動優(yōu)化，得到最優(yōu)的檢測靈敏度，4 種待測農(nóng)藥的保留時(shí)間、母離子和子離子、透鏡補(bǔ)償電壓和碰撞能量參數(shù)如表2 所示。

2.4 線性方程與檢出限

用基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制4 種農(nóng)藥質(zhì)量濃度均分別為2、10、50、100、200、500 μg／L 的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2 儀器工作條件下測定，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），4 種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。分別取2 g 已制備完成的空白柑橘和空白菜心試樣，分別加入質(zhì)量濃度均為100 ng／mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10 mL，得到4 種農(nóng)藥加標(biāo)水平均為5 μg／kg 的加標(biāo)樣品，采用信噪比評估法對方法檢出限和定量限進(jìn)行確定［16］，檢出限按3 倍的信噪比進(jìn)行計(jì)算，定量限按10 倍信噪比計(jì)算。4 種農(nóng)藥的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限如表4 所示。由表4 可知，丁醚脲、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯的質(zhì)量濃度在2～500 μg／L 范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.991，檢出限為0.02～1.25 μg／kg，定量限為0.05～5.0 μg／kg，表明該方法具有較高的靈敏度。

表4 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別以空白柑橘、菜心作為基質(zhì)，加入質(zhì)量濃度均為100 ng／mL 的丁醚脲、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，柑橘基質(zhì)中分別得到5、10、50 μg／kg 3 個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)樣品，菜心基質(zhì)中分別得到10、20、50 μg／kg 3 個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)樣品。每個(gè)濃度水平加標(biāo)樣品平行測定6 次，測定結(jié)果見表5。

表5 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

由表5 可知，4 種農(nóng)藥殘留在柑橘基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為71.6%～109%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～14.4%；4 種農(nóng)藥殘留在菜心基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為82.0%～109%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～10.0%，符合測定要求，表明該法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 樣品檢測

隨機(jī)采集南寧農(nóng)貿(mào)市場的柑橘和菜心樣品10個(gè)批次，按照所建實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，所有樣品中均未檢出丁醚脲、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯4種農(nóng)藥殘留。

3 結(jié)語

采用QuEChERS 原則凈化樣品，以外標(biāo)法進(jìn)行定量，建立了同時(shí)測定果蔬中的丁醚脲、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯4 種農(nóng)藥殘留含量的高效液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法。該方法快速準(zhǔn)確，靈敏度高，安全可靠，操作簡單，可應(yīng)用于蔬菜水果的日常檢測分析。