童世鋒，李雅楠，朱墨，謝銳，劉楊 *

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240)

近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展，人工授精(AI)技術(shù)已在各大規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)得到廣泛應(yīng)用，AI技術(shù)的使用有效提高了養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。目前AI技術(shù)使用的主要是新鮮精液，且技術(shù)已相當(dāng)成熟，但其存在保存時(shí)間短、運(yùn)輸難度大等問(wèn)題，限制了AI技術(shù)的推廣使用[1]。精液冷凍則有效延長(zhǎng)了精子的體外保存時(shí)間且便于運(yùn)輸，擴(kuò)大了精液使用的時(shí)間和空間范圍，有效避免新鮮精液存在的問(wèn)題，除此之外，冷凍精液還可以提高良種公畜的利用率，應(yīng)用于保存種質(zhì)資源、開(kāi)展國(guó)際間種質(zhì)資源交流等方面[2]。目前，牛精液冷凍保存技術(shù)已比較成熟，且在奶牛生產(chǎn)中得到全面的應(yīng)用。但由于在豬精液冷凍過(guò)程中，豬精子對(duì)冷應(yīng)激的敏感度較其他物種更強(qiáng)，低溫更容易對(duì)豬精子造成不可逆的損傷，導(dǎo)致精子凍后活力低、受精率低，與配母豬的妊娠率低、產(chǎn)仔數(shù)少[3]。為降低冷凍過(guò)程中對(duì)精子造成的損傷，研究人員最開(kāi)始主要采用甘油作為冷凍保護(hù)劑，有效提高了冷凍精液的質(zhì)量；其后在豬精液冷凍稀釋液中加入卵黃、糖類等保護(hù)劑，也被證實(shí)可以明顯提高精子活力；隨著對(duì)豬精液冷凍損傷機(jī)理的研究不斷深入，近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明在稀釋液中添加抗氧化劑可明顯改善精子的結(jié)構(gòu)與功能；除了稀釋劑對(duì)豬凍精質(zhì)量的影響，精液稀釋前的平衡時(shí)間、冷凍程序、解凍液以及解凍速率等因素都會(huì)對(duì)精子的凍后活力、活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性和受精率等指標(biāo)產(chǎn)生不同的影響[2,4]。

由此可見(jiàn)，影響豬凍精質(zhì)量的因素復(fù)雜多樣，但目前對(duì)其研究還不夠透徹，因此更加深入地分析影響豬冷凍精液質(zhì)量的因素，有利于進(jìn)一步優(yōu)化豬精液冷凍保存技術(shù)，提高冷凍精液的質(zhì)量，繼而促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)更科學(xué)高效的發(fā)展。

1 豬精液冷凍損傷機(jī)理

1.1 化學(xué)損傷

精液冷凍過(guò)程中，隨著溫度的降低，當(dāng)溫度處于-5 ℃至-15 ℃時(shí)，細(xì)胞外液會(huì)先于細(xì)胞內(nèi)液形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞外的滲透壓高于細(xì)胞內(nèi)，精細(xì)胞內(nèi)的水分由內(nèi)向外流出，由此引起細(xì)胞嚴(yán)重脫水、電解質(zhì)失衡、脂蛋白變性以及膜融合等，對(duì)精細(xì)胞造成不可逆的化學(xué)損傷[2-3]。

1.2 物理?yè)p傷

研究表明，對(duì)冷凍精液造成主要損傷的不是長(zhǎng)時(shí)間保存于低溫環(huán)境中，而是因?yàn)槔鋬龊徒鈨鲞^(guò)程中-15 ℃至-60 ℃這個(gè)危險(xiǎn)溫區(qū)[3]。在此溫區(qū)內(nèi)，精細(xì)胞內(nèi)由液態(tài)向玻璃態(tài)過(guò)渡，細(xì)胞內(nèi)的水分形成冰晶，由于冰晶的體積增大和運(yùn)動(dòng)，對(duì)精子質(zhì)膜、細(xì)胞器等造成機(jī)械性損傷，導(dǎo)致精細(xì)胞失活[5]。

1.3 氧化損傷

氧化損傷即在溫度變化的影響下精子內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致精細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)量大大增多并且ROS的動(dòng)態(tài)平衡被打破，ROS在精細(xì)胞內(nèi)過(guò)量累積，對(duì)精子的結(jié)構(gòu)和活性等造成一系列損傷[2]。研究表明豬精子質(zhì)膜上多不飽和脂肪酸的含量高于其他物種，多不飽和脂肪酸更容易受到ROS的攻擊產(chǎn)生過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)量的脂類氧化物，致使精子質(zhì)膜、DNA片段完整性、酶活性、精子活力等嚴(yán)重受損，因此豬凍精較其他物種更容易發(fā)生自身氧化損傷[5-6]。

2 影響豬凍精質(zhì)量的因素

2.1 冷凍前處理

首先，采精季節(jié)會(huì)影響豬精液的可凍性，研究表明冬春季節(jié)采集的豬精液冷凍后活力顯著高于夏秋季節(jié)采集的精液[7]。公豬射精過(guò)程中不同部分精液也會(huì)表現(xiàn)出不同的可凍性，富精子部分精液凍后活力顯著高于其他部分，并且前10 mL凍后質(zhì)量最佳[8]。由于豬精子膜具有高蛋白/磷脂比和低膽固醇/磷脂比的特性，豬精子對(duì)低溫的敏感度更高，也更容易造成精子冷休克，調(diào)整冷凍前的平衡時(shí)間有利于減少冷休克對(duì)精子的損傷[9]。Sch?Fer等[10]將隔夜運(yùn)輸20 h后的豬精液在17 ℃分別保存2 h和24 h再進(jìn)行冷凍，保存2 h的精子解凍后運(yùn)動(dòng)能力明顯高于保存24 h的，但隨著解凍時(shí)在38 ℃孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，差異會(huì)消失；同時(shí)證實(shí)精液在5 ℃平衡4 h再進(jìn)行冷凍，精子活力、細(xì)胞質(zhì)膜和DNA片段完整性等明顯高于平衡2 h、24 h和48 h的精液。Wasilewska等[11]發(fā)現(xiàn)豬精液在10 ℃保存24 h后再進(jìn)行冷凍保存，精子質(zhì)膜完整性、活力等高于17 ℃保存2 h的精液，這一發(fā)現(xiàn)有可能改善豬精液冷凍技術(shù)。

此外，冷凍前不同的離心條件對(duì)豬冷凍精液的質(zhì)量也有影響。Carvajal等[12]在不同離心條件下對(duì)公豬精液進(jìn)行處理分析，發(fā)現(xiàn)精子頂體完整率和復(fù)蘇能力在2 400g離心3～5 min條件下最高，明顯高于800g和400g離心相同時(shí)間，表明高轉(zhuǎn)速短時(shí)間離心更有利于冷凍精液的質(zhì)量。Gosalvez等[13]證實(shí)了離心管類型不會(huì)對(duì)豬冷凍精液質(zhì)量造成顯著影響，而離心力對(duì)其有顯著作用。除離心力外，在冷凍前采用40 Mpa的靜水壓力處理豬精液，冷凍精液用于人工授精后母豬妊娠率和產(chǎn)仔數(shù)明顯提高，且不會(huì)影響仔豬健康[14]。

目前，既有研究表明在豬精液冷凍時(shí)保留一部分精清能夠提高冷凍精液中精子的存活率和活力，但也有研究表明精清會(huì)導(dǎo)致冷凍精子的功能和活力受損，射精過(guò)程中不同階段的精清組分差異、精清的劑量對(duì)豬冷凍精液質(zhì)量都會(huì)產(chǎn)生不同影響，因此，是否在冷凍精液中保留精清有待進(jìn)一步研究[15]。近來(lái)還有研究表明精液一步恒溫稀釋與兩步和三步分級(jí)稀釋相比，一步恒溫稀釋的精液在凍后活力、穩(wěn)定性和抗逆性等方面的表現(xiàn)更具優(yōu)勢(shì)[16]。

2.2 稀釋液

豬冷凍精液稀釋液主要由稀釋劑、營(yíng)養(yǎng)劑、保護(hù)劑以及其他添加劑組成，保護(hù)劑的主要成分為緩沖物質(zhì)、電解物質(zhì)、冷凍保護(hù)劑、抗氧化劑和抗菌物質(zhì)等。稀釋液中的每一成分都會(huì)對(duì)冷凍精液的質(zhì)量產(chǎn)生影響。

2.2.1 冷凍保護(hù)劑

甘油是目前最常用的一種滲透性冷凍保護(hù)劑，可以滲透到豬精子細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞內(nèi)的水發(fā)生水合反應(yīng)，減少冰晶的形成，從而減輕冰晶對(duì)精細(xì)胞的物理?yè)p傷，有效地保護(hù)冷凍精液。當(dāng)前研究表明在稀釋液中添加2%～3%的甘油，精子的活力和頂體完整率最高，過(guò)高濃度的甘油對(duì)精子有毒害作用[17]。此外，甘油還被證明在豬精液冷凍過(guò)程中具有抗凋亡作用，抑制精細(xì)胞的凋亡[18]。馬麗等[19]在稀釋劑中添加不同濃度的二甲基亞砜(DMSO)以及不同比例的甘油和DMSO混合液，研究其對(duì)豬冷凍精液的保護(hù)效果，結(jié)果表明添加60 mL/L的DMSO和30 mL/L的DMSO與甘油3∶1混合液，精子的質(zhì)膜完整率、頂體完整率顯著提高。劉宏等[20]研究表明在稀釋劑中添加5%的二甲基甲酰胺(DMF)，能夠代替稀釋液中的甘油，具有較好的豬精液冷凍保護(hù)作用。卵黃也是常用的冷凍保護(hù)劑之一，胡傳活等[21]在稀釋液中添加不同比例的卵黃，對(duì)比分析表明豬精液冷凍稀釋劑中添加20%的卵黃，能夠較好地維持精子的頂體完整性和活力。Bathgate等[22]通過(guò)比較不同類型的卵黃對(duì)豬冷凍精液的保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)雞卵黃的保護(hù)效果優(yōu)于鴨卵黃和鵪鶉卵黃。卵黃作為豬精液冷凍保護(hù)劑的主要有效成分是低密度脂蛋白，能夠較好地保護(hù)精子細(xì)胞膜。張偉[23]研究表明用8%的低密度脂蛋白代替稀釋液中20%的卵黃，精子的頂體完整率顯著提高。

糖類作為非滲透性保護(hù)劑，能夠調(diào)節(jié)精細(xì)胞外的滲透壓，防止精細(xì)胞過(guò)度脫水，從而有效提高豬冷凍精液的質(zhì)量。楊升等[24]研究表明在傳統(tǒng)的ZO稀釋液(Zorlesco)基礎(chǔ)上添加4%水蘇糖能夠顯著提高冷凍精子的活力、頂體完整率以及質(zhì)膜完整性，并表明水蘇糖與甘油共同作用能夠更有效地提高豬凍精質(zhì)量。Gómez-fernández等[25]對(duì)比了在稀釋液中添加3種單糖和5種雙糖對(duì)豬冷凍精液質(zhì)量的影響，結(jié)果表明3種單糖中葡萄糖對(duì)豬凍精的保護(hù)效果最好，5種雙糖中海藻糖對(duì)豬冷凍精液的保護(hù)效果顯著高于其他雙糖，且海藻糖的保護(hù)效果優(yōu)于葡萄糖。潘紅梅等[26]探究了不同雙糖組合對(duì)豬冷凍精液質(zhì)量的影響，結(jié)果表明以66.7%的蔗糖和33.3%的乳糖組合添加于稀釋液中，精子的活力、頂體完整率等顯著高于其他組合?？傊囗?xiàng)研究都表明了葡萄糖[25]、蔗糖[25-26]、乳糖[25-26]、海藻糖[25]和海帶多糖[27]等多種糖類都有效提高了冷凍-解凍后豬精子的活力和受精率。

2.2.2 抗氧化劑

抗氧化劑能夠有效減少精子質(zhì)膜上的不飽和脂肪酸受到ROS攻擊而產(chǎn)生的過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)質(zhì)膜的完整性和功能，顯著提高豬冷凍精液的質(zhì)量。近年來(lái)對(duì)抗氧化劑的研究越來(lái)越深入全面。Lee等[28]在稀釋劑中添加10 mmol/L煙酸(NA)，精子脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)明顯降低，改善了冷凍-解凍后豬精子的質(zhì)膜完整性，表明NA對(duì)豬精子質(zhì)膜的保護(hù)有顯著作用。Namula等[29]研究表明在豬精液冷凍過(guò)程中添加100 μmol/L的綠原酸(CGA)和咖啡酸(CA)可以顯著提高精子活力、存活率和質(zhì)膜完整性。Trzcińska等[30]比較了不同濃度的還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)以及3種抗氧化劑的不同濃度組合在豬精液冷凍過(guò)程中的抗氧化作用，結(jié)果表明在稀釋液中添加單一抗氧化劑時(shí)，添加5.0 mmol/L GSH精子活率最高；SOD和CAT聯(lián)合使用能顯著提高解凍后精子活率。此外，研究還發(fā)現(xiàn)合適濃度的γ-谷維素[31]、α-硫辛酸[32]、芹菜素和阿魏酸[33]等多種抗氧化劑都能有效提高豬冷凍精液的質(zhì)量。除了常用抗氧化劑外，還有部分糖類如紅景天多糖也被證實(shí)可以在豬精液冷凍過(guò)程中增強(qiáng)抗氧化能力，顯著提高精子的活率、質(zhì)膜完整率，有效改善豬冷凍精液的質(zhì)量[34]。

2.2.3 抗菌物質(zhì)

在采精和精液冷凍過(guò)程中精液經(jīng)常會(huì)被細(xì)菌污染，導(dǎo)致精子活力嚴(yán)重下降，在稀釋劑中添加抗菌物質(zhì)能有效減少細(xì)菌污染對(duì)豬冷凍精液的危害。青霉素和慶大霉素等抗生素都被證實(shí)可以有效減少17 ℃保存時(shí)細(xì)菌對(duì)精子的危害[35]。Brya等[36]在稀釋液中添加幾種不同濃度比例的抗生素，通過(guò)對(duì)比分析表明100 g/mL慶大霉素和100 g/mL氟苯尼考聯(lián)合使用，可有效提高15 ℃保存的豬稀釋精液的精子活力、膜完整性和受精率等。近年來(lái)，為避免冷凍精液中大量使用抗生素使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，抗生素替代品的研究也越來(lái)越廣泛。已有研究表明抗菌肽(PMAP-37、PBD1和PBD2等)具備替代豬精液稀釋劑中抗生素的潛能[37-38]。

2.2.4 緩沖物質(zhì)

精子代謝會(huì)使精液的pH值發(fā)生變化，對(duì)精子產(chǎn)生危害，在豬凍精稀釋液中添加檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀等緩沖物質(zhì)能調(diào)節(jié)至適宜的pH值，從而達(dá)到提高冷凍精液質(zhì)量的效果[2]。當(dāng)稀釋劑pH值為8左右的弱堿性時(shí)，豬冷凍精液解凍后精子質(zhì)量明顯提高[39]。Namula等[40]為探究Tris緩沖液對(duì)冷凍-解凍后豬精液質(zhì)量的影響，在稀釋液中加入不同濃度的Tris緩沖液調(diào)節(jié)稀釋液的pH值，結(jié)果表明在稀釋液中添加24 μmol/L的Tris緩沖液，解凍后精子的活率、質(zhì)膜完整率顯著高于其他濃度的試驗(yàn)組，但不同濃度的Tris緩沖液對(duì)精子頂體完整率的影響不顯著。

2.3 冷凍程序

2.3.1 冷凍溫度和速率

豬精液冷凍保存通常是在-196 ℃的液氮中保存，精液從新鮮精液的溫度降至液氮溫度的過(guò)程中，需跨越-5 ℃至-60 ℃的危險(xiǎn)溫區(qū)，危險(xiǎn)溫區(qū)就會(huì)對(duì)精子造成不可逆的損傷。已有研究表明，豬精子的臨界溫度為12 ℃，當(dāng)溫度低于臨界溫度時(shí)，就會(huì)發(fā)生冷休克，損傷精子質(zhì)膜和頂體膜，導(dǎo)致精子活力下降[41]。因此，為了在豬精液冷凍過(guò)程中有效避開(kāi)危險(xiǎn)溫區(qū)對(duì)精子的損傷，需采用一個(gè)合適的冷凍速率。冷凍速率過(guò)快或過(guò)慢會(huì)造成不同程度的物理和化學(xué)傷害。梁鴻斌等[42]通過(guò)比較3種不同的冷凍速率對(duì)豬精液冷凍質(zhì)量的影響，研究表明采用-120 ℃熏蒸10 min精子的頂體完整率和質(zhì)膜完整率顯著優(yōu)于其他2種速率。另還有研究表明不同的入氮溫度對(duì)豬凍精精子活力的影響差異不顯著，但隨著入氮溫度的降低精子活力呈上升趨勢(shì)[43]。

2.3.2 冷凍劑型

不同劑型或同一劑型不同規(guī)格的冷凍保存形式都對(duì)豬冷凍精液的質(zhì)量產(chǎn)生影響，目前常用的冷凍劑型有顆粒型、細(xì)管型、塑料或鋁箔袋型，而目前研究使用最多的是細(xì)管型，細(xì)管型又分為0.25 mL、0.5 mL及5 mL的規(guī)格。劉德玉等[44]比較了不同規(guī)格細(xì)管對(duì)豬冷凍精液質(zhì)量的影響，結(jié)果表明0.5 mL細(xì)管保存的凍精解凍后精子活力最高，頂體完整率最高的為5 mL細(xì)管，使用0.25 mL細(xì)管會(huì)出現(xiàn)公豬品種效應(yīng)。薛琦[45]也證實(shí)了0.5 mL細(xì)管保存的豬凍精的精子活力顯著高于0.25 mL，且當(dāng)采用液氮熏蒸時(shí)，距離液氮液面1.638 cm的熏蒸效果顯著優(yōu)于距離液面2.162 cm，精子活率明顯提高。

2.4 解凍程序

豬精液的解凍過(guò)程同樣也需要跨越危險(xiǎn)溫區(qū)，解凍液以及解凍的溫度和速率都會(huì)對(duì)豬冷凍精液的質(zhì)量產(chǎn)生影響，合適的解凍液、解凍溫度及解凍速率能有效提高解凍后精子的活力和受精率。Yamaguchi等[46]在豬凍精解凍液中添加咖啡因和CaCl2，解凍后的精液用于母豬的人工授精，母豬的妊娠率、產(chǎn)仔率明顯提高，但產(chǎn)仔數(shù)之間的差異不顯著。隨后在解凍液中添加咖啡因被進(jìn)一步證實(shí)可以明顯提高豬凍精解凍后精子的運(yùn)動(dòng)力，且對(duì)精子的頂體完整率無(wú)影響，同時(shí)表明解凍液中咖啡因的添加可以減少母豬子宮炎癥的發(fā)生[47]。在解凍液中添加適量的載脂環(huán)糊精(CLC)，精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率會(huì)顯著提高，但過(guò)量的CLC會(huì)導(dǎo)致精子活力下降[48]。Gadani等[49]則表明在解凍液中添加不同劑量的白藜蘆醇(Res)或表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)不會(huì)損傷豬精子的活力和頂體完整率，并且添加2 μmol/L Res、25 μmol/L或50 μmol/L EGCG可顯著提高受精率。

胡傳活等[43]評(píng)估了3個(gè)不同解凍溫度(37、50和70 ℃)對(duì)解凍后豬精子活力的影響，結(jié)果表明3個(gè)解凍溫度對(duì)凍后活力的影響不顯著，但凍后活力有隨溫度上升而提高的趨勢(shì)。梁鴻斌等[42]研究表明，37 ℃水浴解凍30 s 0.25 mL細(xì)管保存的豬冷凍精液，精子的活力、質(zhì)膜完整率最高。殷方芝等[50]在探究豬冷凍精液5 mL細(xì)管保存效果的影響因素時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同解凍溫度及時(shí)間對(duì)豬精子凍后活力影響不顯著，但42 ℃ 40 s解凍后精子頂體完整率最佳。

3 問(wèn)題與展望

20世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著B(niǎo)eltsville法和Westendorf法2種豬精液冷凍方法的建立，豬精液冷凍技術(shù)已經(jīng)取得重大進(jìn)步，但目前豬凍精主要用于種質(zhì)資源的保護(hù)，在人工授精上的應(yīng)用效果還遠(yuǎn)不及新鮮精液的應(yīng)用效果[3]。未來(lái)隨著在影響豬冷凍精液質(zhì)量因素上的研究更加深入完善，將從根本上提高豬冷凍精液質(zhì)量，豬冷凍精液也將會(huì)在精液長(zhǎng)期保存、豬人工授精、提高養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)效率、加快優(yōu)質(zhì)品種育種進(jìn)程、種質(zhì)資源保護(hù)及交流等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。