蘇文中，李守淼，周光輝，王虎，胡廣杰，黃艷玲，李黎，馬華兵

0 引言

進(jìn)展期食管胃結(jié)合部腺癌（adenocarcinoma of esophagogastric junction,AEG）圍手術(shù)期腹腔熱灌注化療（hyperthermic intraperitoneal chemotherapy,HIPEC）是減少腹腔復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)而提高存活率的有力措施[1]，但其機(jī)制尚未完全明確。HIPEC的治療療效受到腫瘤細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）的負(fù)向調(diào)節(jié)[2]。HSP105b是唯一一種癌癥中顯性陰性突變的HSP，多中心研究結(jié)果顯示HSP105b的低表達(dá)與腫瘤的良好預(yù)后之間存在直接聯(lián)系[3]。HSP105b在胃癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展、不良預(yù)后及輔助化療后的復(fù)發(fā)有關(guān)[4]，但與HIPEC療效的相關(guān)性未見報(bào)道。本研究對(duì)進(jìn)展期AEG腫瘤組織中HSP105b的表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性及與圍手術(shù)期HIPEC治療療效的關(guān)系進(jìn)行分析，進(jìn)而探討HIPEC抗腫瘤的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月—2017年6月安陽市腫瘤醫(yī)院暨河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院腹部腫瘤外科收治的行經(jīng)腹R0根治性切除+D2淋巴結(jié)清除術(shù)的局部進(jìn)展期Siewert Ⅱ型AEG患者。研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前活檢病理確診為腺癌；（2）影像學(xué)排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（3）年齡40～70歲；（4）無手術(shù)、化療禁忌證；（5）無其他惡性腫瘤病史及放化療史；（6）簽署知情同意書，并要求手術(shù)治療；（7）術(shù)中確診侵及漿膜和（或）發(fā)現(xiàn)區(qū)域腫大淋巴結(jié)，而且未發(fā)現(xiàn)腹盆腔種植灶。

所有患者術(shù)前均簽署HIPEC知情同意書、手術(shù)同意書、臨床試驗(yàn)知情同意書，并獲得河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院暨安陽市腫瘤醫(yī)院生命科學(xué)倫理審查委員會(huì)審查同意。術(shù)中探查后確定是否入組，共入組166例。入組患者按手術(shù)先后順序隨機(jī)分為2組（各83例）：治療組（術(shù)后24 h內(nèi)開始給予HIPEC治療，共2次，余給予常規(guī)處理）和對(duì)照組（術(shù)后僅給予常規(guī)處理）。治療組和對(duì)照組患者在年齡、性別、BMI、并發(fā)癥比率、臨床分期、胃切除范圍及消化道重建方式等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 診斷和分期

所有病例術(shù)后檢出淋巴結(jié)均≥20枚，手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查。根據(jù)2016年美國癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer,AJCC）第8版胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行術(shù)后病理分期，分為Ⅱb期患者38例，Ⅲa～b期患者128例。

1.3 手術(shù)治療

所有患者均經(jīng)腹行食管胃結(jié)合部腺癌R0切除+D2淋巴結(jié)清掃，治療組術(shù)中留置腹腔灌注管4根。兩組均無圍手術(shù)期死亡病例。

1.4 預(yù)防性HIPEC治療

治療組患者術(shù)后24 h內(nèi)連接由廣州保瑞醫(yī)療技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BR-TRG-Ⅱ型體腔熱灌注治療系統(tǒng)進(jìn)行治療。所有患者均行2次國產(chǎn)紫杉醇注射液（術(shù)后第1天75 mg/m2,術(shù)后第2天100 mg/m2）的HIPEC。

1.5 標(biāo)本的處理及免疫組織化學(xué)染色

所有標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。玻片用多聚-L-賴氨酸涂覆，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色，確定病理類型。免疫組織化學(xué)染色參照文獻(xiàn)[6]所述，切片用1:100稀釋的兔抗人HSP105b單克隆抗體（GeneTex,美國）4℃孵育24 h。

使用免疫反應(yīng)評(píng)分（IRS）對(duì)HSP105b染色進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估表達(dá)HSP105b的細(xì)胞比例及其相對(duì)染色強(qiáng)度。HSP105b染色強(qiáng)度分級(jí)如下：0，無染色；1+：淺黃色；2+：棕黃色；3+：棕褐色。根據(jù)五個(gè)代表性區(qū)域的至少1 000個(gè)癌細(xì)胞，計(jì)算HSP105b表達(dá)的AEG細(xì)胞百分比。陽性細(xì)胞百分比：無著色細(xì)胞計(jì)0分，1%～10%計(jì)1分，＞10%～50%計(jì)2分，＞50%～100%計(jì)3分。兩項(xiàng)得分相乘，≤3為低表達(dá)，≥4為高表達(dá)。以上結(jié)果由2名病理學(xué)專家（副主任醫(yī)師或主任醫(yī)師）閱片判斷，存在差異時(shí)由2位醫(yī)師一起審查并協(xié)商達(dá)成一致。

1.6 術(shù)后輔助化療及隨訪

術(shù)后4周內(nèi)開始給予輔助化療（SOX三周方案共6周期），其中38例僅給予4～5周期化療（治療組20例，對(duì)照組18例）。術(shù)后以電話、短信及門診相結(jié)合的方式進(jìn)行隨訪，每3月1次。隨訪內(nèi)容：患者的生活質(zhì)量、并發(fā)癥情況、反流性食管炎程度、進(jìn)食量、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況等。隨訪至≥36月或至確診腫瘤復(fù)發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移或非腫瘤因素死亡之日。隨訪截至2019年6月30日。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并使用Log rank檢驗(yàn)比較組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 圍手術(shù)期兩組并發(fā)癥的比較

本研究中治療組的消化道反應(yīng)較輕，僅有5例患者惡心，無嘔吐患者；骨髓抑制發(fā)生率也較低，僅4例出現(xiàn)Ⅰ度血小板減少（未做特殊處理，自行緩解）。未出現(xiàn)白細(xì)胞減少患者，也未出現(xiàn)高敏感患者，僅有3例出現(xiàn)皮膚一過性皮疹，治療結(jié)束后自行緩解。治療組切口感染3例（其中1例合并切口裂開）、吻合口瘺4例（其中1例形成腹腔膿腫）、腸梗阻1例；而對(duì)照組切口感染2例，吻合口瘺3例（其中1例形成腹腔膿腫），無腸梗阻患者。經(jīng)積極治療后患者均治愈。所有患者均未形成彌漫性腹膜炎。兩組在腹腔并發(fā)癥方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.751,P=0.386）。治療組合并肺部感染者8例，發(fā)病比例較高，而對(duì)照組僅4例，但差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.437,P=0.231）。兩組患者均未出現(xiàn)圍手術(shù)期死亡病例。

2.2 進(jìn)展期AEG癌組織中HSP105b蛋白表達(dá)的臨床意義

在癌組織中，HSP105b著色于細(xì)胞核中。166例患者中92例呈高表達(dá)（55.4%），而74例呈低表達(dá)（44.6%）。在進(jìn)展期AEG組織中HSP105b蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，見表1。HSP105b的蛋白表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)性，而僅與是否存在靜脈浸潤明顯相關(guān)（t=4.002,P=0.045）。

2.3 HSP105b表達(dá)強(qiáng)度及是否接受HIPEC治療對(duì)無瘤生存率的影響

所有患者36 月內(nèi)非腫瘤死亡7 例，其中HSP105b高表達(dá)者4例，HSP105b低表達(dá)者3例；治療組4例，對(duì)照組3例。HSP105b高表達(dá)患者1、2年無瘤生存率分別為89.1%、65.2%，與低表達(dá)患者的93.2%、73.0%相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.121,P=0.092;χ2=3.248,P=0.071）；而HSP105b高表達(dá)患者的3年無瘤生存率為42.4%，明顯低于低表達(dá)患者的52.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=35.508,P＜0.001），見圖1。治療組及對(duì)照組各83例，治療組3年無瘤生存率為54.2%，明顯高于對(duì)照組的39.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.622,P=0.032），見圖2。在治療組中，HSP105b高表達(dá)者47例，低表達(dá)者36例，而在對(duì)照組中，HSP105b高表達(dá)者45例，低表達(dá)者38例，其3年無瘤生存率見圖3。各組的3年無瘤生存率從高到低依次為治療組-低表達(dá)（66.7%）、治療組-高表達(dá)（49.8%）、對(duì)照組-低表達(dá)（47.4%）、對(duì)照組-高表達(dá)（35.6%），且均P＜0.05。

表1 進(jìn)展期AEG患者臨床病理特征與HSP105b表達(dá)水平的關(guān)系Table 1 Relation between HSP105b expression and clinicopathological characteristics of patients with advanced AEG

圖1 HSP105b高表達(dá)和低表達(dá)患者的3年無瘤生存率Figure 1 Three-year disease-free survival rate between patients with high and low HSP105b expression

圖2 治療組與對(duì)照組3年無瘤生存率Figure 2 Three-year disease-free survival rates between treatment group and control group

圖3 HSP105b表達(dá)高低及HIPEC治療對(duì)3年無瘤生存率的影響Figure 3 Influence of HSP105b expression and HIPEC treatment on 3-year disease-free survival rate of patients

3 討論

AEG是中國常見的消化道惡性腫瘤之一，根治性手術(shù)切除是目前唯一可以治愈的方法[7]。進(jìn)展期AEG最主要的播散途徑是腹腔種植轉(zhuǎn)移。由于手術(shù)前/中腹腔微轉(zhuǎn)移的存在，即使行根治性切除，仍有較多患者術(shù)后會(huì)出現(xiàn)腹腔復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[8]。而圍手術(shù)期給予HIPEC可通過熱化療的協(xié)同作用和大容量灌注沖刷作用有效殺滅和清除腹腔內(nèi)殘留的癌細(xì)胞和微小轉(zhuǎn)移灶、預(yù)防腹膜轉(zhuǎn)移癌，對(duì)提高進(jìn)展期AEG患者的整體療效具有重要意義[9]。但HIPEC的具體機(jī)制尚未明了。

熱休克蛋白是一組高度保守的分子伴侶蛋白，可以防止蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤折疊[10]。本研究結(jié)果顯示腫瘤組織中的HSP105b蛋白表達(dá)水平高低與患者的年齡、性別、腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)，而僅與是否存在靜脈浸潤明顯相關(guān)。說明HSP105b的表達(dá)水平與腫瘤的靜脈浸潤能力密切相關(guān)，這與在胃腺癌中的研究結(jié)果相一致[4]。

與低表達(dá)組相比，進(jìn)展期AEG患者HSP105b高表達(dá)組1年、2年無瘤生存率無明顯差異，而3年無瘤生存率則明顯下降，這與既往在肺腺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]、胃癌[13]中的研究結(jié)果相一致。因此，可以確定進(jìn)展期AEG癌組織中HSP105b的高表達(dá)與患者的遠(yuǎn)期預(yù)后不良有關(guān)。

我們對(duì)進(jìn)展期AEG患者隨機(jī)分組，分別給予圍手術(shù)期HIPEC治療（治療組）和僅給予常規(guī)處理（對(duì)照組）。結(jié)果顯示治療組的2年、3年無瘤生存率均明顯高于對(duì)照組?？梢钥闯鲞M(jìn)展期AEG患者根治術(shù)后給予圍手術(shù)期HIPEC治療可以減少術(shù)后腹腔復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)率，減緩腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移速度，充分證實(shí)了HIPEC治療的必要性。根據(jù)是否給予了HIPEC治療和腫瘤組織中HSP105b表達(dá)的高低分成4組，計(jì)算其3年無瘤生存率。結(jié)果顯示，HSP105b低表達(dá)患者給予HIPEC治療可以獲得最佳的治療療效（3年無瘤生存率最高）。說明HSP105b低表達(dá)可以加強(qiáng)HIPEC治療的療效，而高表達(dá)可以增加腫瘤細(xì)胞熱化療抵抗[13]，但其具體分子機(jī)制有待后繼研究。本試驗(yàn)不良反應(yīng)較少，且未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，與前期的研究結(jié)果一致，具有較高安全性[14]。

綜上所述，HSP105b蛋白的高表達(dá)預(yù)示著不良預(yù)后，而且HSP105b高表達(dá)增加了癌細(xì)胞的熱化療抵抗。因此，癌組織中HSP105b的蛋白表達(dá)水平可作為進(jìn)展期AEG患者預(yù)后因素及預(yù)測(cè)HIPEC療效的有效生物標(biāo)志物：HSP105b低表達(dá)的進(jìn)展期AEG患者應(yīng)優(yōu)選圍手術(shù)期HIPEC治療，而對(duì)于HSP105b高表達(dá)患者將在后繼的研究中結(jié)合其他分子表型選擇敏感的個(gè)體化治療方案。