張尚師，鄭滔，謝曉玲，鄧南翔，舒兵

（廣東藥科大學1.新藥研究中心；2.藥學院，廣東廣州510006）

關鍵字：奧貝膽酸；雜質(zhì)；合成

奧貝膽酸（obeticholic acid，OCA，結構式見圖1）通過激動法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）間接抑制細胞色素7A1（CYP7A1）的基因表達，從而抑制膽酸的合成，用以治療對熊去氧膽酸應答補加或者無法耐受的原發(fā)性膽汁性膽管炎，具有較高的安全性[1-4]。但是，在工業(yè)化生產(chǎn)奧貝膽酸的過程中，氫化條件較為苛刻，且催化劑隨著反應時間的延長催化性能逐漸下降，導致起始物料中的碳碳雙鍵難以徹底被還原，起始物料中羰基被還原后會引入奧貝膽酸的關鍵雙鍵雜質(zhì)——（Z）-3α，7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷酸（A-1，結構式見圖1），嚴重影響奧貝膽酸的純度[5-6]。為了建立奧貝膽酸的質(zhì)量標準，必須對其中的關鍵雜質(zhì)進行研究，建立該雜質(zhì)的質(zhì)量標準。因此，合成該雜質(zhì)作為對照品，用于后續(xù)的分析和研究，顯得很有必要。

圖1 奧貝膽酸（OCA）和奧貝膽酸雙鍵雜質(zhì)（A-1）的結構Figure 1 The structure of Obeticholic acid(OCA)and double bond impurity(A-1)

本研究以鵝去氧膽酸甲酯為起始原料，通過二異丙基氨基鋰（LDA）拔氫后上TMS 保護劑、三氟化硼（BF3）催化的羥醛縮合反應、對羧酸進行水解和對酮羰基進行還原等步驟得到奧貝膽酸雙鍵雜質(zhì)A-1，合成路線見圖2。

圖2 奧貝膽酸雙鍵雜質(zhì)（A-1）的合成路線Figure 2 The synthesis route of Obeticholic acid double bond impurity(A-1)

1 儀器與試劑

1.1 儀器

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南鞏義予華有限公司）；ZF-7A 手提式紫外分析儀（杭州齊威儀器有限公司）；N-1300V-W 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海艾朗儀器有限公司）；ME104電子天平、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市科瑞儀器有限公司）；Advance Bruker 400M 超導核磁共振波譜儀（瑞士BRUKER 公司）；Thermo 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試劑

鵝去氧膽酸甲酯（分析純，薩恩化學技術有限公司）；三甲基氯硅烷（分析純，薩恩化學技術有限公司）；乙醛溶液（分析純，上海畢得醫(yī)藥有限公司）；三氟化硼乙醚溶液（分析純，上海畢得醫(yī)藥有限公司），其余所有溶劑如甲苯、DMF、DCM、EA 等均為化學純。

2 方法與結果

2.1 3α，7-雙[（三甲基硅烷基）氧基]-6-烯-5β-膽烷酸甲酯（2）的合成

稱取鵝去氧膽酸甲酯（1，10.0 g，24.75 mmol）于500 mL 三口瓶中，加入無水四氫呋喃200 mL，換N2保護，換氣5 次，將反應液置于-40 ℃環(huán)境中，攪拌20 min 后，滴加27.2 mL 二異丙基氨基鋰（LDA，54.45 mmol，2.0 mol/L in THF），攪拌1 h 后，滴加三甲基氯硅烷（5.92 g，54.45 mmol）。攪拌2 h 后，停止反應，將反應液倒入500 mL 飽和氯化銨溶液中，加入100 mL 乙酸乙酯，攪拌20 min 后分液，水層加50 mL 乙酸乙酯萃取3 次，合并有機層，飽和食鹽水洗3次，無水硫酸鈉干燥，徹底旋干，直接投下一步。

2.2 (Z)-3α-羥基-6-亞乙基-7-氧代-5β-膽烷酸甲酯（3）的合成

將得到的粗品溶于300 mL無水二氯甲烷中，加入5.9 mL 乙醛四氫呋喃溶液（1.2 eq，5.0 mol/L in THF，以原料1 計算），將反應體系降溫至0 ℃，滴加5 mL 三氟化硼乙醚溶液，攪拌3 h 后反應完全，將反應液倒入500 mL 稀鹽酸溶液中，分液，水層加100 mL 二氯甲烷萃取3 次，合并有機層，飽和食鹽水洗3 次，無水硫酸鈉干燥，旋干，硅膠柱層析（PE/EA:64/1-8/1）得到中間體2，6.3 g，兩步反應產(chǎn)率59%。1H NMR(400 MHz,MeOD)δ：6.03(q,J=7.1 Hz,1H),3.64(s,3H),3.62-3.45(m,1H),2.63(dd,J=13.0,4.2 Hz,1H),2.29 (tdd,J=12.3,7.6,2.8 Hz,3H),2.22-2.09 (m, 1H), 2.02 (dd,J=9.6, 3.2 Hz, 1H), 1.98-1.82(m, 3H), 1.81-1.71 (m, 1H), 1.66 (d,J=7.1 Hz, 4H),1.57-1.45 (m, 3H), 1.45-1.35 (m, 2H), 1.33-1.23 (m,3H),1.23-1.04(m,5H),0.99(s,3H),0.92(d,J=6.5 Hz,3H),0.64(s,3H)。ESI-MS(m/z):431.4[M+H]+。

2.3 (Z)-3α-羥基-6-亞乙基-7-氧代-5β-膽烷酸（4）的合成

稱取中間體3（4.0 g，9.3 mmol）于250 mL 反應瓶中，加入50 mL 甲醇，攪拌使之溶解，加入10%NaOH 溶液10.0 mL，50 ℃攪拌1 h。反應結束后，放冷，旋干甲醇，加入20 mL 水，冰浴下攪拌10 min，滴加5%稀鹽酸調(diào)pH=4～5，過濾，濾餅用水洗2～3 次，干燥后乙醇重結晶得到中間體4，無需純化，直接投下一步反應。

2.4 (Z)-3α，7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷酸（A-1）的合成

稱取中間體4（2.0 g，4.81 mmol）于250 mL 反應瓶中，加30 mL水攪拌，加入50%NaOH溶液2.0 mL，攪拌使之溶解。滴加由NaBH4（363 mg，9.56 mmol）、1.5 mL 水和0.3 mL 50%NaOH 溶液組成的混合溶液（參照文獻[7-8]方法）。加畢，90 ℃下反應5 h。反應結束后將反應液倒入100 mL 冰飽和NH4Cl 溶液中，攪拌，加飽和檸檬酸溶液調(diào)pH=4～5。加30 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，飽和食鹽水洗后無水硫酸鈉干燥，室溫旋干，硅膠柱分離（DCM∶MeOH=120∶1～30∶1，0.5% HAc），得到奧貝膽酸雙鍵雜質(zhì)A-1，白色固體，1.34 g，產(chǎn)率67%，純度97.2%（示差檢測器），mp 221.3～224.5 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ：5.77-5.54 (m, 1H),4.04-4.01 (m,1H),3.75-3.52(m,1H),2.58-2.36(m,2H),2.34-2.20(m,1H),2.06-1.98(m,1H),1.97-1.78(m,4H),1.76-1.58(m,7H),1.53-1.19 (m,11H),1.18-1.00 (m,2H),0.96 (d,J=6.2 Hz,3H),0.80(s,3H),0.67(s,2H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ：178.43,140.65,113.55,72.39,70.37,55.19,54.08,44.52,43.77,43.11,39.13,38.69,35.17,34.44,34.36,33.79,30.13,29.94,29.15,27.69,26.21,21.91,20.32,17.51,11.51,11.29。ESI-MS(m/z)：417.1[M-H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻[7-8]報道的一致，詳見圖3。

3 討論

在本合成路線中，使用還原試劑將7-羰基還原為7-α羥基是研究的關鍵。常見的還原劑有氫化鋁鋰、硼氫化鈉、硼氫化鉀、氫氣鈀碳體系等。由于氫化鋁鋰能夠還原羧酸、氫氣鈀碳體系可以還原6-烯基，均不能得到目標雜質(zhì)A-1。本研究參照奧貝膽酸的合成方法，使用硼氫化鈉進行還原。從立體結構方面來看，7 位的羰基突出于膽烷酸骨架外側(cè)，H負離子從位阻較小的環(huán)下側(cè)進攻羰基，得到動力學穩(wěn)定的7β-羥基，而在較高溫度下，由于β位空間位阻較大，因此，7β-羥基會轉(zhuǎn)變?yōu)闊崃W穩(wěn)定的7α-羥基。

圖3 奧貝膽酸雙鍵雜質(zhì)（A-1）的氫譜（A）和碳譜（B）Figure 3 The1H NMR(A)and 13C NMR(B)spectra of Obeticholic acid double bond impurity(A-1)

本研究以鵝去氧膽酸甲酯為起始原料，在LDA作用下，使3α，7 位接上了TMS 保護基，然后在三氟化硼乙醚的催化下，與乙醛發(fā)生羥醛縮合反應得到乙烯基鵝去氧膽酸甲酯，最后經(jīng)堿水解、硼氫化鈉還原羰基后得到奧貝膽酸關鍵雜質(zhì)A-1。本方法制備的雜質(zhì)A-1 純度高，可直接用于建立奧貝膽酸原料藥的質(zhì)量標準和相關雜質(zhì)分析。