趙銘宇，呂 波，李 灼，石 晶，劉桂蘭

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院婦科·黑龍江 哈爾濱 150036)

外陰硬化性苔蘚(VLS)的確切病因和發(fā)病機制尚不清楚，目前普遍認(rèn)為該病為多因素致病，包括自身免疫、細胞增殖、感染因素、遺傳和局部刺激等[1]。近年來國內(nèi)外研究一致認(rèn)為，VLS具有遺傳易感性，且自身免疫因素可能是VLS發(fā)生發(fā)展的主要原因之一[2]。盡管其確切的發(fā)病機制仍存在爭議，但其在外陰癌發(fā)病中具有潛在作用[3]。該病病變部位特殊，病因研究難以深入，對疾病的發(fā)生不能預(yù)防，給治療帶來了局限性[4]。本研究旨在探討中國漢族婦女外陰硬化性苔蘚患者中醫(yī)辨證分型與HLA-ABDRB1基因多態(tài)性的相關(guān)性，為該病的病因?qū)W提供依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選自2005年1月—2013年12月于黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院及哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、第二醫(yī)院、黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的病歷資料完整的外陰硬化性苔蘚(VLS)患者76 例；其中肝腎陰虛型40例(A組)，肝經(jīng)濕熱型36例(B組)。A組患者40例，21～30歲3例，31～40歲11 例，41～50歲19例，51～60歲7例，平均年齡(42.73±7.98)歲。B組36 例，21～30 歲 4 例，31～40 歲18 例，41～50 歲11 例，51～60 歲3 例，平均年齡(38.64±9.48)歲。另選取女性健康體檢者62 人(選自合作單位哈醫(yī)大一院)做為正常對照，21～30 歲 8 例，31～40 歲22 例，41～50 歲26 例，51～60 歲6 例，平均年齡(40.30±11.72)歲。各組年齡比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 病例納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合VLS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，中醫(yī)辨證為肝腎陰虛型和肝經(jīng)濕熱型[6]；2)年齡20～60 周歲；3)患者本人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)外陰上皮內(nèi)瘤樣病變，或病理檢查確診為原位癌、浸潤癌等；2)伴有其他免疫相關(guān)性疾病及腫瘤、精神神經(jīng)疾病者。

1.3 正常對照組納入標(biāo)準(zhǔn) 1)知情同意者受試；2)健康體檢者，排除VLS及其它相關(guān)免疫性疾病及腫瘤，排除精神神經(jīng)疾病者。

2 方法

2.1 基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)檢測

PCR-SSP方法。所有患者和健康對照組空腹取靜脈血2.0～5.0 mL，EDTA抗凝，提取白細胞后置于-20 ℃保存，利用人類基因組DNA提取試劑盒Biovision提供)提取DNA，-70 ℃保存待用，使用鹽析法提取全血基因組DNA。PCR擴增反應(yīng)體積在50 uL，94 ℃變性5 min，然后94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，5 個循環(huán)后改退火溫度為58 ℃，共計34個循環(huán)。

2.2 統(tǒng)計學(xué)分析 HLA-ABDRB1基因頻率通過計數(shù)測得，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果見表1。

表1 各組HLA-ABDRB1基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)檢測結(jié)果(例)

由表1可見：HLA-B*15等位基因在肝腎陰虛、肝經(jīng)濕熱兩組中出現(xiàn)頻率明顯高于正常對照組，與正常組相比差異明顯(P<0.01)。HLA-B*40等位基因在肝腎陰虛組明顯低于正常對照組(P<0.01)；肝經(jīng)濕熱組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。HLA-DRB1*12等位基因在各病例組中出現(xiàn)頻率均高，在肝腎陰虛組、肝經(jīng)濕熱組出現(xiàn)頻率與對照組相比有極顯著性差異(P<0.01)。

4 討論

外陰硬化性苔蘚(VLS)是常見的外陰皮膚疾病，發(fā)病率約為14.6/10萬[5，7]，本病惡變率約為3%～4%[6，8]。既往有關(guān)VLS的研究中，均證實本病是與免疫遺傳相關(guān)的疾病[7-10]。中醫(yī)學(xué)將本病歸于“陰癢”等前陰病中。

本課題組之前的研究在對231中國漢族女性外陰白色病變患者(其中外陰硬化性苔蘚123例，外陰鱗狀上皮增生92例)中醫(yī)證侯分布特征的調(diào)查研究結(jié)果顯示，肝腎陰虛型占據(jù)所調(diào)查VLS的56.10%(69例)，肝經(jīng)濕熱型占29.27%(36例)，而其它證型均不足總?cè)藬?shù)的5%。說明VLS的發(fā)病與肝腎陰虛有著極其密切的關(guān)系，并由此推測肝腎陰虛可能是VLS外陰皮膚萎縮、干澀不適的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[9，11]。

肝腎陰虛型居于該病中醫(yī)證型之首，說明肝腎在本病中占有重要的地位。先天稟賦不足，后天津液耗傷均可導(dǎo)致肝腎陰虛。肝腎陰虛陰膚失于濡養(yǎng)，可表現(xiàn)為干澀萎縮。所以VLS以肝腎陰虛型最為多見。而下焦局部環(huán)境潮濕，且濕郁化熱，濕熱下注；加之現(xiàn)代人多好食肥甘厚膩，生活安逸少勞，從而釀濕生熱，導(dǎo)致濕熱循經(jīng)下注，發(fā)為陰部瘙癢，此為肝經(jīng)濕熱型最主要致病因素[10，12]。本研究選取與VLS發(fā)病最為相關(guān)的兩種中醫(yī)證型，即肝腎陰虛型VLS患者40例、肝經(jīng)濕熱型VLS患者36例，研究其與HLA-ABDRB1基因多態(tài)性的相關(guān)性。

HLA(human leukocyte antigen)受控于人類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的基因簇，定位于第6染色體短臂上，是目前所知人體最復(fù)雜的多態(tài)系統(tǒng)(具有顯著的人種、民族和地域的差異)，是免疫遺傳學(xué)、免疫生物學(xué)以及生物化學(xué)等學(xué)科重要研究領(lǐng)域[11-14]。

對于HLA 抗原與VLS發(fā)病的研究很多，其中認(rèn)可較多的為HLA-DQ7，該基因在幼女VLS的陽性率為63.3%(19/30)[13，15]，據(jù)報道VLS患者中具有高表達的基因有HLA-A29、HLA-B40、HLA-B44、HLA-AW31、HLA-DQ7、HLA-DQ8、HLA-DQ9 等。Aslanian FM等[14，16]研究得出HLA-B*15等多個等位基因與硬化萎縮性苔蘚相關(guān)。一項關(guān)于187例英國北歐女性外陰硬化性苔蘚患者的研究顯示，與對照組相比HLA-DRB1*12頻率增加[15，17]。

本研究顯示HLA-B*15、-DR*12等位基因與中國漢族婦女VLS的兩個主要中醫(yī)證型均具有相關(guān)性，是其易感基因。其與VLS的相關(guān)性與國外報道相吻合。HLA-B*40等位基因是肝腎陰虛型VLS的抗性基因，而肝經(jīng)濕熱型VLS病人的發(fā)病卻與HLA-B*40無相關(guān)性。HLA-B*40等位基因在各組中的差異性異常表達體現(xiàn)了VLS不同中醫(yī)辨證分型之間差異性的免疫遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的存在。提示同一疾病中，HLA基因在不同地域、不同種族人群中表達的一致性，及不同中醫(yī)辨證分型之間的顯著差異性。

HLA分子自身極大的等位基因多態(tài)性可以作為多基因遺傳性疾病的一個遺傳標(biāo)記，提示和尋找VLS的高危人群, 從而加強該病的早期預(yù)防，延緩疾病病變的發(fā)生、發(fā)展。由于病例數(shù)原因，下一步研究將擴大樣本量，并進行多中心研究，重視人群低頻率基因位點和單倍型的檢測，綜合考慮基因連鎖不平衡等因素的影響。