蔡郁輝 劉金波 曹 陽(yáng) 張廷濤 晁宏偉

結(jié)腸癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈明顯的上升趨勢(shì)，近年來(lái)隨著手術(shù)理念的更新、新輔助治療方案的改進(jìn)及腹腔鏡操作技術(shù)的進(jìn)步，結(jié)腸癌患者的總體生存期得到明顯提高[1]。但結(jié)腸癌術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍然是影響患者長(zhǎng)期生存的重要因素。DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白(MMR)參與了多種重要的生物學(xué)過(guò)程，其完整表達(dá)對(duì)保證細(xì)胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要意義[2]。若DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)出現(xiàn)缺陷則可能使細(xì)胞出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定，突變率顯著提高[3]。目前，關(guān)于MMR蛋白表達(dá)狀態(tài)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，在不同的研究中存在著截然相反的研究結(jié)論[4-5]。因此，我們回顧性分析了2006年3月至2012年1月我院收治的294例行結(jié)腸癌根治術(shù)的患者臨床資料，探討MMR缺失與Ⅱ、Ⅲ期結(jié)腸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，以期能為臨床判斷患者預(yù)后提供更多、更準(zhǔn)確的臨床指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2012年3月至2018年1月濮陽(yáng)市人民醫(yī)院普外一科收治的行結(jié)腸癌根治術(shù)的患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①腺癌。②術(shù)后病理檢查確認(rèn)為Ⅱ期或Ⅲ期。③術(shù)前未行放化療或生物治療。④行根治性手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)合并有其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤病史。②圍術(shù)期死亡的病例。③臨床資料完整或隨訪數(shù)據(jù)不全。④患有嚴(yán)重臟器功能疾病，如心力衰竭、腎功能不全等。⑤家族性遺傳性結(jié)腸癌。⑥術(shù)后化療非FOLFOX、5-Fu/LV方案。最終，共納入294例患者，其中男性201例，女性93例。年齡30～82歲，中位年齡59歲。腫瘤分化以中、高分化為主，共228例，低分化66例。Ⅱ期、Ⅲ期分別有128例、166例。

1.2 主要試劑

MLHl鼠抗人單克隆抗體、MSH2鼠抗人單克隆抗體、MSH6鼠抗人單克隆抗體、PMS2鼠抗人單克隆抗體，均采購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。DAB顯色試劑盒、免疫組化SP試劑盒分別購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司、美國(guó)Zymed 公司。一抗工作濃度設(shè)置為1∶100。

1.3 免疫組化檢測(cè)及結(jié)果判定

取組織，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋處理后，切片。脫蠟、水化：采用恒溫烤箱常規(guī)脫蠟處理，并快速采用浸入二甲苯中，依次進(jìn)行由高到低不同濃度乙醇進(jìn)行水化處理。抗原修復(fù)：采用雙氧水孵育，并經(jīng)高溫(電磁爐1000 w，加熱2 min)抗原修復(fù)液修復(fù)組織細(xì)胞抗原，之后放入涼水中，靜置，待到自然冷卻。丟棄抗原修復(fù)液，依次進(jìn)行PBS沖洗(3遍×3 min)、雙氧水孵育(3%,靜置15 min)、蒸餾水沖洗、PBS浸泡(3遍×3 min)等步驟；滴加工作液，室溫孵育10 min，甩去工作液，加一抗室溫孵育2 h，PBS沖洗(3 min×3次)。加二抗，孵育20～30 min(37 ℃)，采用PBS沖洗(2 min×3次)。顯色，DAB顯色，蘇木精精染(20 s),自來(lái)水沖洗(30 min)，采用由低到高濃度酒精梯度脫水，透明、封片、鏡檢。以PBS代替一抗設(shè)置陰性對(duì)照，以正常大腸黏膜上皮表達(dá)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。進(jìn)行半定量分析，以出現(xiàn)棕色顆粒為HMGA2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。染色強(qiáng)度無(wú)染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)0～3分。同時(shí)每張切片在高倍鏡下觀察時(shí)，隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，公式：細(xì)胞陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞/同類細(xì)胞總數(shù)×100%。根據(jù)陽(yáng)性率進(jìn)行計(jì)分，0(0分)、<25%(1分)、25%～50%(2分)、50%～75%(3分)，>75%(4分)。兩者相乘，根據(jù)乘積結(jié)果分級(jí)：“-”(0分)判定為MMR表達(dá)缺失，“+”(1～4分)、“++”(5～8分)判定為MMR低表達(dá)，“+++”(9～12分)判定為MMR高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析，MMR狀態(tài)與患者臨床病理參數(shù)關(guān)系分析采用卡方檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic風(fēng)險(xiǎn)模型。影響復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及總體生存率的危險(xiǎn)因素分析采用Cox單因素及多因素模型進(jìn)行。 生存分析采用kaplan-Meier分析，并采用Log-rank 檢驗(yàn)比較MMR狀態(tài)對(duì)患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、總體生存率的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR狀態(tài)單因素分析

MMR狀態(tài)與患者腫瘤部位、分化程度、分期相關(guān)(P<0.05)。但與患者性別、年齡、手術(shù)切除淋巴結(jié)數(shù)量、治療模式、化療周期無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 MMR狀態(tài)與患者臨床病理參數(shù)關(guān)系的單因素分析/例

2.2 MMR狀態(tài)與患者臨床病理參數(shù)關(guān)系的多因素分析

將上述單因素分析中有意義的指標(biāo)納入Logstic回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤部位、分化程度、分期均是影響HMGA2蛋白表達(dá)的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 MMR狀態(tài)與患者臨床病理參數(shù)關(guān)系的多因素分析

2.3 影響預(yù)后單因素分析

年齡、T分期、分化程度、N分期均為影響患者總體生存率、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的危險(xiǎn)因素。總體生存率與MMR狀態(tài)有關(guān)，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率與MMR狀態(tài)無(wú)關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 影響預(yù)后單因素分析/例

2.4 影響患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、總體生存率的多因素分析

多因素分析結(jié)果顯示，僅有N分期是影響患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。僅有腫瘤分化程度、N分期、MMR狀態(tài)是影響患者總體生存率的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 影響患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、總體生存率的多因素分析

2.5 MMR狀態(tài)對(duì)患者無(wú)病生存率及總體生存率的影響

至隨訪截止日期，220例pMMR患者中，69例出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(31.4%)，74例dMMR患者中，13例出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(17.6%)，兩組患者的無(wú)病生存率差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.240，P=0.022)。見(jiàn)圖1。220例pMMR患者中，48例死亡(21.8%)，74例dMMR患者中，9例死亡(12.2%)。兩組患者的總體生存率差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(χ2=3.934，P=0.047)，見(jiàn)圖2。

圖1 pMMR組與dMMR組5年無(wú)病生存曲線 圖2 pMMR組與dMMR組5年總體生存曲線

3 討論

結(jié)腸癌具有高度異質(zhì)性，目前僅有微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測(cè)[6]、鼠類肉瘤病毒癌基因檢測(cè)[7]、鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌基因同源B基因[8]檢測(cè)可應(yīng)用于結(jié)腸癌分期及預(yù)后判斷。其中，DNA復(fù)制中的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)異?？蓪?dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定，在約85%的遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌患者中存在著DNA序列的不當(dāng)表達(dá)[9]。然而，在散發(fā)性結(jié)直腸癌中，微衛(wèi)星不穩(wěn)定也有著一定的檢出率。國(guó)內(nèi)針對(duì)MMR在散發(fā)性結(jié)腸癌中表達(dá)的研究較少，在我們的研究中，294例患者中，74例患者存在MMR表達(dá)缺失(25.2%)，陽(yáng)性率略低于文獻(xiàn)報(bào)道。我們推測(cè)這可能與許多研究者均采用了敏感性、特異性更高的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)等特異性更高的檢測(cè)方法有關(guān)。同時(shí)，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)幾乎全部來(lái)自于國(guó)外，中國(guó)的研究數(shù)據(jù)較少，無(wú)法排除結(jié)腸癌表達(dá)的種族性、地區(qū)性差異。

單因素分析結(jié)果顯示，MMR表達(dá)狀態(tài)與患者腫瘤部位、分化程度、分期相關(guān)。多因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤部位、分化程度、分期是影響MMR表達(dá)狀態(tài)的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。腫瘤分化程度越低、分期越高，MMR表達(dá)缺失的發(fā)生率就越高。這與Hinrichsen[10]，Lewis[11]的研究結(jié)論一致。我們推測(cè)這可能與上皮鈣黏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄受生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路中的 Snail、Twist等基因調(diào)控機(jī)制相關(guān)。MMR表達(dá)缺失會(huì)抑制上皮鈣黏蛋白基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞間極性消失而誘發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，而EMT正是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程。

在一項(xiàng)大型的多中心的回顧性分析中發(fā)現(xiàn)[12]，結(jié)直腸癌4中分子亞型CMS2～4的信號(hào)通路、遺傳學(xué)特征、臨床特征存在明顯差異。CMS1存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的特征，好發(fā)于結(jié)腸近端，預(yù)后較差。CMS2則好發(fā)于遠(yuǎn)端結(jié)腸，存在WNT/MYC途徑的異常激活。CMS3也常合并存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定，且伴有KRAS突變。CMS4則以間質(zhì)浸潤(rùn)為特征。研究發(fā)現(xiàn)，存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的相關(guān)腫瘤組織能產(chǎn)生新蛋白，其加工后的肽段可由MHC-1呈遞，因此，微衛(wèi)星不穩(wěn)定雖然可影響患者預(yù)后，但未來(lái)有可能免疫治療的重要靶點(diǎn)。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，年齡、分化程度、T分期、N分期是影響患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、總體生存率的危險(xiǎn)因素。MMR狀態(tài)與患者總體生存率相關(guān)，但與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率無(wú)關(guān)。進(jìn)一步的多因素分析結(jié)果顯示，僅有N分期是影響患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。僅有腫瘤分化程度、化療與否、N分期、MMR狀態(tài)時(shí)影響患者總體生存率的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。這表明。MMR表達(dá)缺失可作為判斷結(jié)腸癌患者預(yù)后的1個(gè)可靠指標(biāo)。

綜上所述,腫瘤部位、分化程度、分期與MMR表達(dá)狀態(tài)密切相關(guān)。MMR表達(dá)缺失患者預(yù)后明顯較差，可作為判斷患者預(yù)后的1個(gè)潛在標(biāo)志物。但本研究為單中心研究，且采用的是敏感性較低的免疫組化法，未來(lái)在多中心聯(lián)合、增加樣本量、改進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，或能為MMR與結(jié)腸癌關(guān)系的研究提供更具說(shuō)服力的臨床證據(jù)。