楊 楠 丁 錨 閆 峰 師文娟 黃語悠 趙詠梅

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實驗室 北京市老年病醫(yī)療研究中心 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室 腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100053)

缺血性卒中占全部腦卒中的79%，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點，是嚴重威脅人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，除在有限的時間窗內(nèi)應(yīng)用重組組織型纖溶酶原激活劑進行溶栓外，缺少有效的治療和預(yù)防方法[1]。遠隔缺血預(yù)適應(yīng)(remote ischemic preconditioning, RIPC)是指通過對非重要器官的重復(fù)缺血/缺氧，顯著增強其他遠隔的靶器官或組織對缺血/缺氧的耐受能力。RIPC不直接作用于靶器官，而是在其他非重要器官進行，避免了對重要器官(如腦和心臟)直接進行預(yù)適應(yīng)可能引起的缺血風(fēng)險。本課題組以往的研究[2-3]表明，RIPC對腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護作用，但相關(guān)作用機制尚不完全清楚。

自噬是真核生物中重要的胞內(nèi)降解機制，在缺乏營養(yǎng)的生長環(huán)境或應(yīng)激刺激下，細胞啟動自噬。研究[4]顯示，在腦缺血中自噬是一把雙刃劍，既可加重腦缺血損傷，也可防治腦缺血[4]。輕度或中度的自噬激活能促進細胞生存，而過度的自噬激活則促進細胞死亡。Beclin1和LC3B均為自噬相關(guān)基因，參與了自噬體的形成[5]。本課題組前期研究[6]結(jié)果均表明，腦缺血再灌注損傷后，腦內(nèi)Beclin1和LC3B的表達增高，說明腦缺血可導(dǎo)致自噬水平升高。應(yīng)用自噬抑制劑3-MA可顯著下調(diào)大鼠缺血區(qū)的自噬相關(guān)蛋白LC3水平，縮小腦梗死體積，減輕腦損傷，說明抑制自噬過度激活可保護腦缺血再灌注損傷[7]。

有研究[8]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)對自噬有調(diào)控作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)是蛋白質(zhì)合成的重要場所，在細胞代謝和各種病理過程中起著關(guān)鍵作用。ER內(nèi)環(huán)境平衡的破壞會導(dǎo)致ERS。ERS發(fā)生時，激活eIF2α的激酶蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)與ER分子伴侶GRP78發(fā)生解離，GRP78與ER內(nèi)大量的未折疊蛋白結(jié)合，以協(xié)助其正確折疊，這一過程會觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)[9]。UPR的激活導(dǎo)致ER伴侶蛋白水平升高，激活包括PERK/eIF2α 等信號通路[10]。ERS可以通過PERK/eIF2α信號通路激活自噬[8]。在小鼠胚胎成纖維細胞中，敲除PERK/eIF2α基因可抑制ERS誘導(dǎo)的自噬，說明PERK/eIF2α信號通路對于ERS誘導(dǎo)的自噬是必需的[11]。

研究[12]顯示，心肌缺血再灌注損傷的保護作用是通過抑制自噬完成的，提示在腦以外的重要器官中抑制自噬過度激活可能是缺血再灌注損傷的潛在保護機制。但是，自噬是否參與RIPC的腦保護作用尚不清楚。因此，本研究采用后肢RIPC方法對大鼠大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注大鼠進行保護，觀察腦缺血大鼠再灌注24 h后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B以及ER分子伴侶GRP78和ERS相關(guān)蛋白p-eIF2α的表達，從而研究RIPC保護大鼠局灶性腦缺血損傷過程中PERK/p-eIF2α通路及自噬水平的變化，探討RIPC保護腦缺血損傷的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

小動物呼吸機和麻醉機(Harvard Apparatus公司,美國)、手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司,德國)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(CMA 150, Carnegie Medicin公司,瑞典)、雙極電凝器(ACC100,北京德威醫(yī)療器械有限公司)、冰凍切片機(Thermo Fisher Scientific公司,美國)、熒光顯微鏡(Nikon公司,日本)。恩氟烷和水合氯醛購自河北一品制藥公司，Beclin1、LC3B、GRP78、p-eIF2α、NeuN抗體均購自美國CST公司。

1.2 實驗動物分組及處理

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，北京維通利華實驗動物公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。24只SD大鼠采用抽簽法隨機分為3組：假手術(shù)(Sham)組、MCAO組、RIPC+MCAO組，每組8只大鼠。飼養(yǎng)于SPF級動物室，自由進食進水。

1.3 動物模型制作

1)RIPC[2]：RIPC+MCAO組進行RIPC。首先分離大鼠雙側(cè)股動脈，動脈夾夾閉雙側(cè)股動脈10 min，之后松開動脈夾，再灌注10 min，構(gòu)成一個循環(huán)，每天連續(xù)進行3個循環(huán)，連續(xù)進行3d。其余兩組大鼠只切開皮膚后縫合。

2)MCAO模型制作：MCAO大鼠模型的制備依照改良Zea Longa法[13]。先在70%(體積分數(shù))N2O和30%(體積分數(shù))O2中混合5%(體積分數(shù))恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，后改用2%(體積分數(shù))恩氟烷維持麻醉。大鼠經(jīng)頸部作正中切口，切開皮膚和皮下組織，分離右側(cè)頸總動脈并夾閉，頸外動脈凝斷后，將尼龍線栓自頸外動脈殘端插進頸內(nèi)動脈，至線栓頂端到達距頸總動脈分叉約1.8～2.0 cm有阻力感處停止。缺血90 min 后，拔出線栓進行再灌注。逐層縫合肌肉、皮膚，再次消毒。術(shù)中監(jiān)測大鼠各項生理參數(shù)在正常范圍。手術(shù)成功后的大鼠提尾懸空時身體向正常側(cè)彎曲[14]，模型制作失敗后隨即補充。

1.4 免疫熒光雙標染色

各組大鼠于再灌注后24 h用水合氯醛腹腔注射麻醉，快速斷頭取腦，行腦組織連續(xù)冰凍切片(厚度約為20 μm)，-80 ℃保存。取Sham組、MCAO組以及RIPC+MCAO組大鼠腦組織冰凍切片，于預(yù)冷的4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛中固定10 min后，用0.2%(體積分數(shù))TritonX-100破膜10 min，之后滴加5%(體積分數(shù))的山羊血清室溫封閉30 min，棄血清，之后分別滴加Beclin1與NeuN抗體(Beclin1抗體1∶200稀釋，NeuN抗體1∶300稀釋)、GRP78與Beclin1抗體(均1∶200稀釋)、GRP78與LC3B抗體(均1∶200稀釋)，或Beclin1與p-eIF2α抗體(均1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜。陰性對照不加一抗，用PBS替代。次日將切片用PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300稀釋)，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗后，用含DAPI的封片劑封片。將封片后的切片置于熒光顯微鏡下觀察大鼠腦皮質(zhì)的缺血半暗帶區(qū)[15]。在相同的放大倍數(shù)及參數(shù)下，每張腦組織冰凍切片隨機選取4個視野照相，使用NIS Element軟件統(tǒng)計陽性細胞數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RIPC抑制MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)Beclin1的表達

免疫熒光雙標染色結(jié)果顯示，在 MCAO大鼠腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)可見Beclin1陽性細胞及NeuN陽性細胞，其中 Beclin1陽性細胞為綠色熒光，NeuN陽性細胞為紅色熒光，所有細胞的胞核為藍色熒光。圖像合并后，綠色與紅色熒光重合，表明Beclin1與神經(jīng)元共定位(圖1A)，即腦缺血再灌注后Beclin1在大鼠缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元內(nèi)表達。

Sham組沒有缺血半暗帶區(qū)，其與缺血半暗帶相對應(yīng)的腦區(qū)內(nèi)偶見Beclin1綠色熒光陽性細胞，MCAO組大鼠再灌注24 h，缺血半暗帶區(qū)可見大量Beclin1綠色熒光陽性細胞，RIPC+MCAO組大鼠缺血半暗帶區(qū)Beclin1陽性細胞數(shù)量較MCAO組明顯減少(圖1A)，三組間Beclin1陽性細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，MCAO組Beclin1陽性細胞較Sham組明顯增高(P<0.05)，RIPC+MCAO組Beclin1陽性細胞較MCAO組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

圖1 免疫熒光雙標染色法檢測腦缺血再灌注后24 h Sham、MCAO與RIPC+MCAO組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1與NeuN的表達 Fig.1 Expression of Beclin1 and NeuN in cerebral ischemic penumbra of Sham, MCAO and RIPC+MCAO groups after 24 h reperfusion which was examined with immunofluorescence double stainingA: A representative double immunofluorescence staining showed the colocalization of Beclin1 (green) and NeuN (red) in the ischemic penumbra of MCAO rats. Scale bar=20 μm. B: quantification of Beclin1 positive cell. Data are means±SD (n=5). *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; RIPC: remote ischemic preconditioning; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole

2.2 MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)GRP78分別與Beclin1和LC3B共定位

免疫熒光雙標染色結(jié)果顯示，MCAO組大鼠再灌注24 h腦缺血側(cè)半暗帶區(qū)內(nèi)，GRP78陽性細胞呈綠色，Beclin1和LC3B陽性細胞均呈紅色，胞核呈藍色。合并圖像發(fā)現(xiàn)，綠色熒光與紅色熒光重合，表明GRP78分別與Beclin1和LC3B共定位，提示在缺血再灌注后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3B表達的上調(diào)與ER分子伴侶GRP78相關(guān)(圖2)。

圖2 腦缺血大鼠再灌注24 h后半暗帶區(qū)GRP78分別與Beclin1和LC3B 共定位Fig.2 GRP78 was colocalized with Beclin1 and LC3B respectively, which was examined with immunofluorescence staining in the ischemic penumbra of MCAO group rats after 24 h reperfusionA representative double immunofluorescence staining showed the colocalization of GRP78(green)with Beclin1(red) and LC3B(red) respectively in the ischemic penumbra of MCAO rats. Scale bar=20 μm. MCAO: middle cerebral artery occlusion; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.3 MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)Beclin1與p-eIF2α共定位，且RIPC抑制MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)Beclin1和p-eIF2α雙標陽性細胞的表達

通過免疫熒光雙標染色可見，MCAO組大鼠再灌注24 h缺血側(cè)半暗帶區(qū)內(nèi)，呈紅色熒光的陽性細胞是Beclin1，呈綠色熒光的陽性細胞是p-eIF2α，藍色標記的是細胞核。合并圖像發(fā)現(xiàn)，綠色熒光與紅色熒光重合，表明Beclin1與p-eIF2α共定位(圖3A)，提示在腦缺血再灌注后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達上調(diào)與ERS相關(guān)蛋白p-eIF2α相關(guān)。

Sham組大鼠沒有缺血半暗帶區(qū)，其與缺血半暗帶相對應(yīng)的腦區(qū)內(nèi)未見Beclin1和p-eIF2α雙標陽性細胞。而MCAO組、RIPC+MCAO組大鼠缺血半暗帶區(qū)可見Beclin1和p-eIF2α雙標陽性細胞(圖3A)，三組間Beclin1和p-eIF2α雙標陽性細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，MCAO組Beclin1和p-eIF2α雙標陽性細胞較Sham組明顯增高(P<0.05)，RIPC+MCAO組Beclin1和p-eIF2α雙標陽性細胞較MCAO組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。

圖3 免疫熒光雙標染色法檢測腦缺血再灌注后24 h Sham、MCAO與RIPC+MCAO組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1與p-eIF2α的表達Fig.3 Expression of Beclin1 and p-eIF2α in cerebral ischemic penumbra of Sham, MCAO and RIPC+MCAO groups rats after 24 h reperfusion which was examined with immunofluorescence double stainingA: A representative double immunofluorescence staining showed the colocalization of Beclin1 (red) and p-eIF2α (green) in the ischemic penumbra of MCAO rats. Scale bar=20 μm. B: quantification of Beclin1 and p-eIF2α double positive cells. Data are means±SD (n=5). *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; RIPC: remote ischemic preconditioning; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

3 討論

缺血適應(yīng)作為腦缺血損傷的有效保護策略，近年來引起人們的廣泛關(guān)注,在機體重要器官進行缺血預(yù)適應(yīng)難度較大，且易形成致死性缺血，故不宜被臨床采用。本課題組前期研究[16]顯示，采用遠端肢體進行缺血預(yù)適應(yīng)，對腦或其他重要器官也同樣具有保護作用，且更適合向臨床轉(zhuǎn)化。因此，深入研究 RIPC對腦缺血的保護作用并探討其相關(guān)機制，對臨床應(yīng)用RIPC治療缺血性腦血管病具有重要意義。本文旨在探究RIPC對局灶性腦缺血損傷大鼠再灌注后24 h缺血半暗帶區(qū)自噬水平的影響，以及RIPC是否通過抑制PERK/p-eIF2α通路，從而避免自噬過度激活，產(chǎn)生腦保護作用，進一步明確RIPC發(fā)揮神經(jīng)保護作用的具體機制。

自噬是機體的一種防御性反應(yīng)，適度自噬具有維持細胞穩(wěn)態(tài)和促進細胞生存的作用，但自噬的過度激活則可導(dǎo)致細胞死亡。Beclin1在自噬的起始階段具有重要作用，并且能夠促進LC3的形成以啟動自噬[17]。研究[18]表明，在大腦缺血再灌注幾小時后，自噬相關(guān)蛋白表達就開始上升。為了探究RIPC對腦缺血再灌注后自噬的影響，本研究檢測了RIPC對各組大鼠缺血側(cè)腦組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達。研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，MCAO組大鼠腦缺血再灌注后24 h缺血側(cè)腦組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達水平明顯升高，表明腦缺血再灌注誘導(dǎo)Beclin1過量產(chǎn)生，自噬被過度激活。通過將Beclin1與NeuN進行免疫熒光雙標染色發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白Beclin1與神經(jīng)元共定位，說明缺血再灌注后Beclin1在缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元內(nèi)表達增多，提示此時神經(jīng)元發(fā)生過度自噬，這可能是造成腦缺血神經(jīng)元損傷的主要原因之一。本課題組前期的研究[16]結(jié)果表明，給予RIPC處理的MCAO大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低，腦梗死體積明顯減小。而本研究結(jié)果顯示，予以RIPC的MCAO大鼠腦缺血半暗帶區(qū)自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達水平明顯下降。因此，RIPC對腦缺血再灌注損傷的保護作用很可能是通過減少Beclin1產(chǎn)生，進而抑制神經(jīng)元過度自噬實現(xiàn)的。有研究[19]報道，聯(lián)合應(yīng)用RIPC和缺血后適應(yīng)可通過抑制自噬保護腦缺血大鼠，而本研究則證明單獨應(yīng)用RIPC可通過抑制神經(jīng)元自噬，發(fā)揮腦保護作用。

LC3作為自噬體形成的標志，與自噬空泡形成的數(shù)量有關(guān)，代表自噬的活性程度。LC3有3種不同的亞型(LC3A、LC3B、LC3C)，通常檢測組織中LC3B蛋白的含量代表組織內(nèi)LC3的表達量[20]。最近研究[21]顯示，ER分子伴侶GRP78的表達上調(diào)可以激活自噬，而GRP78的缺失可抑制ERS誘導(dǎo)的自噬激活，說明GRP78很可能是ERS和自噬激活中的橋梁蛋白。本研究選取缺血再灌注24 h大鼠腦組織進行免疫熒光雙標染色，結(jié)果顯示，GRP78分別與自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3B共定位，提示在缺血再灌注后自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3B的產(chǎn)生與ERS有關(guān)，ER分子伴侶GRP78的產(chǎn)生很可能誘導(dǎo)自噬過度激活。

ERS導(dǎo)致的UPR反應(yīng)可激活PERK/eIF2α信號通路，進而引起自噬激活[10]。文獻[11]報道，依賴PERK的eIF2α磷酸化可誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細胞自噬，敲除PERK/eIF2α基因可抑制ERS誘導(dǎo)的自噬。本研究結(jié)果顯示，ERS相關(guān)蛋白p-eIF2α可與自噬相關(guān)蛋白Beclin1共定位，提示在腦缺血再灌注后自噬的過度激活與ERS相關(guān)蛋白p-eIF2α有關(guān)，該結(jié)果進一步說明腦缺血再灌注后自噬的過度激活與ERS相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，腦缺血再灌注24 h后p-eIF2α和Beclin1雙標陽性細胞數(shù)較Sham組明顯增多，說明腦缺血再灌注24 h后，ERS很可能通過激活PERK/eIF2α通路，導(dǎo)致自噬過度激活。給予RIPC處理的大鼠腦組織中p-eIF2α和Beclin1雙標陽性細胞數(shù)較MCAO組大鼠明顯下降，提示在腦缺血再灌注后，RIPC可能通過減少ERS的產(chǎn)生，從而抑制自噬過度激活，減少神經(jīng)元自噬性死亡，發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，RIPC很可能通過抑制ERS，使神經(jīng)元中的自噬相關(guān)蛋白表達下調(diào)，進而抑制腦缺血再灌注自噬的過度激活，從而減少神經(jīng)元死亡，發(fā)揮腦保護作用。目前有關(guān)RIPC通過抑制ERS調(diào)控自噬發(fā)揮腦保護作用的相關(guān)研究尚未見報道，本研究為深入研究RIPC的相關(guān)機制提供了新證據(jù)，對臨床應(yīng)用RIPC治療缺血性腦病有一定的理論指導(dǎo)意義。