羅傳真，張羽晨，婁江城，劉曉麗，谷長勤，張萬坡，程國富，胡薛英

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種導(dǎo)致患病仔豬高死亡率以及母豬嚴(yán)重的繁殖與呼吸系統(tǒng)障礙的一種高度接觸傳染性疾病，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。據(jù)早期研究報(bào)道觀察發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染后，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，局部出血，間質(zhì)中存在大量淋巴細(xì)胞與少數(shù)巨噬細(xì)胞浸潤，同時(shí)，對PRRSV導(dǎo)致的血液循環(huán)障礙提出了猜想與疑問[3-4]。隨后，有研究發(fā)現(xiàn)，感染PPRSV后仔豬腎除上述腎小球病變外，腎小管上皮細(xì)胞變性腫脹、壞死脫落[5-6]。但目前關(guān)于PRRSV對腎的具體損傷機(jī)制以及血液微循環(huán)障礙的產(chǎn)生沒有進(jìn)行深入的研究。20世紀(jì)60年代以來，電鏡已被廣泛用于腎疾病的病理診斷，尤其對腎小球疾病的分類和鑒別的診斷價(jià)值[7]。因此，本研究在仔豬感染PRRSV后，通過IHC對病毒進(jìn)行定位，同時(shí)，主要利用透射電鏡技術(shù)對腎組織中腎小球足細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管及間質(zhì)等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了系統(tǒng)的觀察，結(jié)合腎損傷相關(guān)血清生化指標(biāo)水平，對觀察到的血液微循環(huán)相關(guān)病理變化進(jìn)行分析，有利于在亞細(xì)胞水平揭示PRRSV感染仔豬腎損傷的病變特征和發(fā)生發(fā)展規(guī)律，為深入闡明PRRSV的感染致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及處理

從湖北某豬場隨機(jī)購買10頭40日齡的通城仔豬。抽取全血分離血清，送武漢科前生物公司進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒和偽狂犬病病毒抗原、抗體檢測，檢測結(jié)果全部為陰性。隨機(jī)選擇3頭仔豬作為對照，不做任何處理。余下仔豬采用PRRSV-WUH3株(毒株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉榜教授保存饋贈)，按3 mL·15 kg-1(106PFU·mL-1)進(jìn)行攻毒，其中，肌內(nèi)注射2 mL·15 kg-1， 滴鼻1 mL·15 kg-1。感染后第8～17天 進(jìn)行撲殺、剖檢。抽取全血分離血清，并采集仔豬腎組織。

1.2 血清生化分析

取血清進(jìn)行腎功能生化指標(biāo)分析(采用全自動干式生化分析儀SPOTCHEM EZ SP-4430)。

1.3 病毒的定位

取腎組織于4%多聚甲醛溶液中固定，然后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片制作。切片脫蠟至水，在枸櫞酸鹽溶液(pH=6.0)中微波高溫修復(fù)抗原，5%山羊血清封閉非特異性，孵育鼠抗PRRSV抗體(抗體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)方六榮教授饋贈)4 ℃過夜，采用基因科技有限公司GTVisionTM+抗鼠/兔通用型免疫組化試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明、樹脂封片。

1.4 電鏡樣品制作

取腎組織皮質(zhì)部分固定于2.5%戊二醛溶液中,4 ℃ 保存，轉(zhuǎn)至電鏡固定液中固定2～4 h。隨后磷酸緩沖液漂洗3次。1%鋨酸溶液室溫固定2 h。磷酸緩沖液漂洗3 次。組織依次入梯度酒精與丙酮進(jìn)行脫水。812包埋劑包埋，37 ℃過夜。60 ℃聚合48 h。超薄切片機(jī)(Leica, Leica UC7)切片60～80 nm 超薄切片。鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和酒精溶液、枸櫞酸鉛各染色15 min)，切片室溫干燥過夜。

1.5 數(shù)據(jù)分析與圖像采集

血清學(xué)檢測為Ttest雙尾檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。石蠟切片采用生物光學(xué)顯微鏡(Nikon80i)觀察，高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)(NIS-Elements)進(jìn)行結(jié)果觀察與記錄。超微切片采用透射電子顯微鏡(HITACHI, HT7700)觀察，采集圖像分析(HITACHI, Hitachi TEM system control)。

2 結(jié) 果

2.1 血清生化指標(biāo)檢測

通過血清生化指標(biāo)血清尿素氮(BUN)與肌酐(CRE)的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染組兩個(gè)指標(biāo)顯著升高(表1)。

2.2 病毒定位

免疫組化染色結(jié)果顯示，與正常對照組(圖1A)相比，感染組腎小管部分上皮細(xì)胞脫落至管腔內(nèi)，病變嚴(yán)重的腎小管上皮細(xì)胞胞核壞死溶解；間質(zhì)中可觀察到巨噬細(xì)胞彌散浸潤。在腎小球、變性的腎小管、間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞內(nèi)均可觀察到陽性(棕褐色或棕黃色)信號(圖1B～F)。

表1 血清腎功能生化指標(biāo)水平

*.P<0.05

2.3 超微病理結(jié)構(gòu)變化

透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：對照組，腎小球毛細(xì)血管袢、基底膜結(jié)構(gòu)清晰(圖2A)，足細(xì)胞足突緊貼于毛細(xì)血管基底膜外，排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，突起之間可見裂孔(圖3A)；腎小球毛細(xì)血管基底膜及系膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，基底膜未見明顯增厚；血管內(nèi)皮細(xì)胞靠于基底膜內(nèi)側(cè)，形成連續(xù)緊密連接的有孔內(nèi)皮(圖4A)。PRRSV感染組，腎小球毛細(xì)血管袢擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及纖維蛋白，表明微血栓形成(圖2B、C)；足細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量增加，伴有足突廣泛融合或足突微絨毛化(圖3B、C)；血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，線粒體等膜性細(xì)胞器腫脹，內(nèi)皮細(xì)胞間孔減少、消失，細(xì)胞質(zhì)電子密度降低，部分毛細(xì)血管基底膜與血管內(nèi)皮細(xì)胞間有電子致密物沉積(圖4B、C)。

A.對照組，PRRSV無陽性表達(dá)，Bar=50 μm；B.感染組，PRRSV在腎小球內(nèi)足細(xì)胞胞質(zhì)呈陽性(→標(biāo)注)，Bar=50 μm；C. 感 染組，PRRSV在變性壞死的腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈陽性(→標(biāo)注)，Bar=50 μm；D. 感染組，PRRSV在間質(zhì)中巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈陽性(→標(biāo)注)，Bar=100 μm；E、F.感染組，PRRSV在間質(zhì)中巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈陽性(→標(biāo)注)，Bar=50 μmA. Control group, negative expression of PRRSV, Bar=50 μm; B. Infected group The cytoplasm of glomerular cells was positive for PRRSV (→ labeled), Bar=50 μm； C. Infected group, PRRSV was positive in the cytoplasm of denatured and necrotic renal tubular epithelial cells (→ labeled), Bar=50 μm; D. Infected group, PRRSV was positive in the cytoplasm of macrophages in the stroma (→ labeled), Bar=100 μm; E, F. Infected group, PRRSV was positive in the cytoplasm of macrophages in the stroma (→ labeled), Bar=50 μm圖1 PRRSV在通城仔豬腎中的分布(IHC)Fig.1 Distribution of PRRSV in kidney of Tongcheng piglets (IHC)

A. 對照組，腎小球毛細(xì)血管袢、足細(xì)胞、基底膜結(jié)構(gòu)清晰，Bar=10 μm；B. 感染組，腎小球毛細(xì)血管袢擴(kuò)張，Bar=10 μm；C.感染組，腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)充滿紅細(xì)胞、血小板及纖維蛋白，微血栓(☆標(biāo)注)形成，Bar=10 μmA. Control group, the glomerular capillary loops, the foot cells, the basal membrane structure were clear, Bar=10 μm; B. Infected group, glomerular capillary loop expansion, Bar=10 μm; C. Infected group, the glomerular capillaries are full of red blood cells, platelets and fibrin, microthrombotic (☆labeled) formation, Bar=10 μm圖2 PRRSV感染豬腎小球的超微結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Ultrastructural changes of glomeruli in PRRSV infected pigs

A. 對照組，足細(xì)胞足突緊貼于毛細(xì)血管基底膜外，突起之間可見裂孔(→標(biāo)注)，足細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，Bar=2 μm；B. 感染組， 足細(xì)胞溶酶體數(shù)量增加(△ 標(biāo)注)，伴有足突廣泛融合(→標(biāo)注)，Bar=2 μm；C. 感染組，足突微絨毛化(→標(biāo)注)，Bar=5 μmA. Control group, podocyte podocytes were closely attached to the basal membrane of capillaries, and there were cracks between the processes (→ labeled)， podocytes were neatly arranged and had normal structure, Bar=2 μm; B. Infected group, the number of podocyte lysosomes increased (△ labeled), accompanied by extensive foot process fusion (→ labeled), Bar=2 μm; C. Infected group, foot processes microvillous (→ labeled), Bar=5 μm圖3 PRRSV感染豬腎小球中足細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Ultrastructural changes of podocytes in renal glomeruli of PRRSV infected pigs

A. 對照組，血管內(nèi)皮細(xì)胞形成連續(xù)緊密連接的有孔內(nèi)皮(→標(biāo)注)，Bar=2 μm；B. 感染組，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹(→標(biāo)注)，Bar=2 μm；C. 感染組，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，毛細(xì)血管基底膜與血管內(nèi)皮細(xì)胞間有電子致密物沉積(→標(biāo)注)，Bar=2 μmA. Control group, vascular endothelial cells formed perforated endothelium with continuous and tight connection (→ labeled), Bar=2 μm; B. Infected group, swelling of vascular endothelial cells in the infected group (→ labeled), Bar=2 μm; C. Infected group, the vascular endothelial cells were swollen, and there was electron dense deposition between the capillary basement membrane and the vascular endothelial cells (→ labeled), Bar=2 μm圖4 PRRSV感染豬腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Ultrastructural changes of renal glomerular endothelial cells infected with PRRSV in pigs

對照組腎遠(yuǎn)曲小管為單層立方上皮細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰(圖5A)，腎近曲小管為單層立方上皮細(xì)胞，微絨毛明顯，形成完整的刷狀緣(圖6A)；腎小管及間質(zhì)毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)清晰(圖7A)。而感染組，遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)電子密度明顯降低，有大量空泡，線粒體腫脹，電子密度降低，線粒體嵴斷裂、溶解(圖5B、C)；近曲小管上皮細(xì)胞電子密度增加，溶酶體數(shù)量增加(圖6B)；有的腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核消失，細(xì)胞膜崩解，細(xì)胞器電子密度增加，結(jié)構(gòu)紊亂；間質(zhì)內(nèi)有中性粒細(xì)胞浸潤(圖7B)。

3 討 論

PRRSV在仔豬肺組織中不僅引起常見的間質(zhì)性肺炎，同時(shí)，引起廣泛的血液微循環(huán)障礙[8]，本研究發(fā)現(xiàn)，腎組織同樣存在血液微循環(huán)障礙。血清生化指標(biāo)BUN、CRE可用于預(yù)測腎損傷[9]，本試驗(yàn)結(jié)果顯示在感染PRRSV后，腎小球、腎小管及間質(zhì)均有PRRSV陽性表達(dá)，且血清指標(biāo)較對照組顯著性升高，提示PRRSV引起仔豬嚴(yán)重腎損傷。

腎小球?yàn)V過膜主要由足細(xì)胞、系膜基質(zhì)、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及基底膜組成。足細(xì)胞在腎小球維持毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)完整性、執(zhí)行濾過功能上發(fā)揮著重要的作用[10]。微小病變性腎病(MCD)、膜性腎病(MN)和IgA腎病等共同病理學(xué)變化都存在足細(xì)胞損傷。在足細(xì)胞損傷過程中，最顯著的形狀改變是足突融合[11-13]，而嚴(yán)重疾病狀態(tài)下，足突廣泛融合會引起腎小球?qū)Υ蠓肿游镔|(zhì)的通透性增加[14]。

A.對照組，腎遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，Bar=5 μm；B. 感染組，腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)電子密度明顯降低，Bar=10 μm；C.感染組，線粒體腫脹，嵴斷裂、溶解(△標(biāo)注)，Bar=5 μmA. Control group, renal distal convoluted tubule epithelial cells， Bar=2 μm; B. Infected group, the cytoplasmic electron density of renal tubular epithelial cells was significantly decreased， Bar=10 μm; C. Infected group, mitochondria swelled, cristae ruptured, and dissolved (△ labeled), Bar=5 μm圖5 PRRSV感染豬腎遠(yuǎn)曲小管的超微結(jié)構(gòu)變化Fig.5 Ultrastructural changes of distal convoluted tubules in PRRSV infected pigs

A. 對照組，腎近曲小管為單層立方上皮，微絨毛明顯形成完整的刷狀緣，Bar=10 μm；B. 感染組，近曲小管上皮細(xì)胞電子密度增加，溶酶體(△標(biāo)注)數(shù)量增加，Bar=5 μmA. Control group, the proximal convoluted tubules were single cuboidal epithelium, and the microvilli obviously formed a complete brush border, Bar=10 μm; B. Infected group, electron density and lysosome (△ labeled) number of epithelial cells increased in proximal convoluted tubule, Bar=5 μm圖6 PRRSV感染豬腎近曲小管的超微結(jié)構(gòu)變化Fig.6 Ultrastructural changes of proximal convoluted tubule of PRRSV infected pig kidney

A. 對照組，腎小管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，Bar=20 μm；B. 感染組，腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核消失，間質(zhì)中有中性粒細(xì)胞浸潤(△標(biāo)注)，Bar=10 μmA. Control group, renal tubules and interstitium were clearly structured, Bar=20 μm; B. Infected group, the nuclei of the renal tubular epithelial cells have disappeared and neutrophils are present in the stroma (△ labeled), Bar=10 μm圖7 PRRSV感染豬腎間質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)變化Fig.7 Ultrastructural changes of renal interstitium in PRRSV-infected pigs

本研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染仔豬腎組織內(nèi)少數(shù)足細(xì)胞呈現(xiàn)病毒陽性。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，足突減少并出現(xiàn)廣泛融合或足突微絨毛化，同時(shí)，足細(xì)胞內(nèi)大量的溶酶體形成，線粒體等膜性細(xì)胞器腫脹，這些足細(xì)胞凋亡早期特點(diǎn)變化說明PRRSV引起足細(xì)胞發(fā)生了損傷[15]。結(jié)合血清生化分析結(jié)果，PRRSV感染仔豬腎小球的通透性失衡，濾過功能障礙[16]。

腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過膜組成之一，除了執(zhí)行濾過功能外，血管內(nèi)皮細(xì)胞還有抗凝、防血栓形成的作用[17]。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)會引起的血管壁損傷，是血栓形成的條件之一[18]。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染仔豬腎小球內(nèi)皮細(xì)胞間孔減少、消失，細(xì)胞質(zhì)電子密度降低，部分毛細(xì)血管基底膜與血管內(nèi)皮細(xì)胞間有電子致密物沉積。這些超微結(jié)構(gòu)變化與曹劍波等[19-20]的研究一致，但由于電鏡樣品的局限性，沒有觀察到清晰的病毒顆粒。可以推測毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫大、活化、增生，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，引起血管壁損傷[21]，導(dǎo)致了腎小球內(nèi)微血栓的形成。

1970年，Striker等[22]發(fā)現(xiàn)腎小管與間質(zhì)的損害與腎功能存在著顯著的相關(guān)性，并首次提出腎小管的損傷在腎損傷發(fā)展中產(chǎn)生重要的影響。由于腎小管有重吸收和調(diào)節(jié)尿液的作用，消耗大量ATP酶，故線粒體在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，腎小管變性溶解，并表達(dá)PRRSV陽性。這與翟研妮等[24-25]的研究一致。超微結(jié)構(gòu)損傷主要見于上皮細(xì)胞中線粒體腫脹，嵴斷裂、溶解，同時(shí)發(fā)現(xiàn)溶酶體大量增加。由于腎小管上皮細(xì)胞中的線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，導(dǎo)致其氧化磷酸化功能發(fā)生障礙，激活了線粒體凋亡途徑，從而引起腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷[26]。說明PRRSV感染后不僅影響了腎小球?yàn)V過率，也損害了腎小管功能。間質(zhì)方面，本研究發(fā)現(xiàn)PRRSV主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)陽性，同時(shí)，可以觀察到中性粒細(xì)胞浸潤，這印證了PRRSV進(jìn)入機(jī)體后在肺泡巨噬細(xì)胞中復(fù)制，隨血液進(jìn)入腎組織，引起炎癥反應(yīng)[27]，但感染仔豬腎組織血液微循環(huán)損傷是否存在巨噬細(xì)胞浸潤等炎癥因素影響有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

采用IHC與透射電鏡對PRRSV感染仔豬腎組織進(jìn)行病毒的定位及超微病理學(xué)觀察，結(jié)合血清學(xué)生化分析，發(fā)現(xiàn)病毒感染能造成嚴(yán)重腎損傷，PRRSV主要分布于腎小球足細(xì)胞、變性的腎小管以及間質(zhì)中巨噬細(xì)胞；超微結(jié)構(gòu)方面腎小球內(nèi)足細(xì)胞足突廣泛融合或纖毛化，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹等損傷導(dǎo)致腎組織微血栓形成，腎小管上皮細(xì)胞各細(xì)胞器普遍受到損傷，多為線粒體的腫脹以及溶酶體的增多為主，提示PRRSV感染仔豬的腎小球?yàn)V過率降低，進(jìn)而對血液微循環(huán)系統(tǒng)造成損傷。