王海波，周永明，王 靜，張 瑞，康 鵬，馬曉東，裴文剛，楊敏敏，史兆國(guó)，秦士貞

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

鋅(Zn)是動(dòng)物必需微量元素之一，不僅參與動(dòng)物機(jī)體酶和功能蛋白的組成，并與養(yǎng)分、遺傳物質(zhì)代謝及激素的功能和活性相關(guān)，在穩(wěn)定生物膜，介導(dǎo)腸道離子轉(zhuǎn)運(yùn)，增加消化酶活性，促進(jìn)細(xì)胞増殖、分化和腸絨毛發(fā)育等方面發(fā)揮重要功能[1-2]。通常，家禽飼料常以ZnSO4作為飼料鋅源，ZnSO4易吸潮結(jié)塊從而破壞飼料中的維生素及其他活性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且吸收利用率低，過度排放到環(huán)境中易造成鋅污染[3]。然而，通過離子交換對(duì)沸石、蒙脫石等黏土礦物富集微量礦物元素，可使微量元素在動(dòng)物腸道內(nèi)合理釋放，持久被動(dòng)物體吸收利用，提高微量元素的利用率，減少微量元素對(duì)環(huán)境的污染[4]。楊雪[5]的研究發(fā)現(xiàn)，載鋅沸石相比ZnSO4和抗生素能提高肉雞日增重、采食量；載鈣蒙脫石可緩解黃曲霉毒素B1(AFB1)誘發(fā)的肉鴨腸黏膜損傷，促進(jìn)腸絨毛發(fā)育[6]；同時(shí)，載銅蒙脫石可顯著提高肉雞小腸絨毛高度[7]。羅有文[8]研究發(fā)現(xiàn)，載鋅凹土具有抑菌和調(diào)節(jié)免疫功能。但關(guān)于載鋅蒙脫石(zinc-montmorillonite, Zn-MMT)作為鋅源的研究鮮見報(bào)道，因此，本試驗(yàn)旨在研究Zn-MMT對(duì)肉雞生產(chǎn)性能、免疫功能及腸道發(fā)育的影響，為Zn-MMT在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

載鋅蒙脫石(赤峰和明化工有限公司)經(jīng)蘭州中檢科測(cè)試技術(shù)有限公司檢測(cè)，鋅含量為10 408.80 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧(CK)、正對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧添加40 mg·kg-1ZnSO4、試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加20、40、60和80 mg·kg-1Zn-MMT(均以Zn含量計(jì)算)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及管理

選擇1日齡健康科寶公雛288只，按體重隨機(jī)分成6個(gè)處理組，每處理6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)8只仔雞。試驗(yàn)采用3層籠養(yǎng)，為期為42 d。飼養(yǎng)管理和常規(guī)免疫按照《科寶肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)》進(jìn)行。采用24 h恒定光照，雞只自由采食、飲水。

1.4 試驗(yàn)日糧

基礎(chǔ)日糧參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)及NRC(1994)配制玉米-豆粕型日糧?；A(chǔ)日糧及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.5 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能 分別于第21和42天，自由飲水下禁食12 h后，以重復(fù)籠為單元，空腹稱量體重，記錄體重(BW)及飼料消耗量。并計(jì)算ADFI、ADG、F/G。

1.5.2 屠宰性能 在第42天，各重復(fù)隨機(jī)選取1只 體重接近該重復(fù)平均值的肉仔雞，自由飲水，禁食12 h，稱重并屠宰，按《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計(jì)方法》[9]規(guī)定方法對(duì)屠宰性能測(cè)定。

1.5.3 免疫器官指數(shù) 分別于第21和42天，每重復(fù)選1只接近平均體重的仔雞屠宰，去除表面結(jié)締組織和脂肪，稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)；免疫器官指數(shù)=器官重量(g)/體重(kg)。

1.5.4 小腸絨毛高度和隱窩深度的測(cè)定 在第42天， 各重復(fù)選1只接近平均體重的肉仔雞進(jìn)行屠宰，分離十二指腸、空腸、回腸，選取1～2 cm， 中段腸道用生理鹽水清洗后迅速放入4%多聚甲醛中保存，送往武漢塞維爾生物科技有限公司制作切片，采用Motic-BA210Digital數(shù)碼顯微鏡對(duì)VH、CD進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算V/C。

1.5.5 脾基因(IL-2、TNF-α、IgG、IgA)表達(dá)檢測(cè) 在試驗(yàn)42 d，從每個(gè)處理中選擇3只接近平均體重的肉雞，迅速屠宰取出脾，液氮速凍，在-80 ℃冰箱中保存直至分析。使用TRIzol(北京全式金生物技術(shù)有限公司)法提取脾組織總RNA，用微量紫外可見分光光度計(jì)(NanoDrop-2000)測(cè)定RNA濃度和純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser)說明，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中備用。并利用Light Cycler?480ⅡSystems熒光定量基因擴(kuò)增儀，采用SYBR?GreenⅠ染料法，以β-actin為內(nèi)參，參照熒光定量試劑盒說明書(SYBR?Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，用2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)量。引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,詳見表2。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理后，采用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示，P<0.05表示顯著水平。

2 結(jié) 果

2.1 Zn-MMT對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

Zn-MMT對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響見表3。由表3 可見，Zn-MMT對(duì)1～21、22～42及1～42日齡肉仔雞的ADFI無顯著影響(P>0.05)，但顯著性影響ADG及1～42日齡的F/G(P<0.05)。與CK和ZnSO4組相比，添加60和80 mg·kg-1Zn-MMT 顯著降低了1～21日齡肉仔雞ADG(P<0.05)，且80 mg·kg-1Zn-MMT顯著降低22～42及1～42日齡的仔雞ADG(P<0.05)；Zn-MMT對(duì)1～21、22～42日齡肉仔雞的ADFI與F/G及1～42日齡肉仔雞的ADFI無顯著影響(P>0.05)，但40 mg·kg-1的Zn-MMT顯著降低了1～42日齡的F/G(P<0.05)。

表1 日糧組成及養(yǎng)分水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

2.2 Zn-MMT對(duì)肉雞屠宰性能的影響

Zn-MMT對(duì)肉雞屠宰性能的影響見表4。由表4可見， Zn-MMT對(duì)胸肌率有顯著影響(P<0.05)，但對(duì)屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腹脂率、腿比率、腿肌率無顯著影響(P>0.05)。相比CK組，添加 Zn-MMT對(duì)肉仔雞42日齡的胸肌率無顯著影響(P>0.05)，但與 ZnSO4組相比，添加40 mg·kg-1的 Zn-MMT顯著提高了42日齡肉仔雞的胸肌率(P<0.05)。

2.3 Zn-MMT對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

Zn-MMT對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響見表5。由表5可見，Zn-MMT對(duì)21日齡肉仔雞法氏囊指數(shù)和42日齡肉仔雞法氏囊指數(shù)和胸腺指數(shù)有顯著性影響(P<0.05)，對(duì)21日齡肉仔雞胸腺和脾臟指數(shù)以及對(duì)42日齡肉仔雞脾臟指數(shù)沒有顯著影響(P>0.05)。與CK組相比， 60 mg·kg-1Zn-MMT顯著升高了21日齡 肉仔雞法氏囊指數(shù)(P<0.05)，但與ZnSO4組相無顯著差異(P>0.05)。與CK組相比， Zn-MMT對(duì)42日齡肉仔雞胸腺指數(shù)無顯著影響(P>0.05)； 但相比ZnSO4組， 40和80 mg·kg-1Zn-MMT顯著提高了42日齡肉仔雞胸腺指數(shù)(P<0.05)。與CK和ZnSO4組相比，60 mg·kg-1Zn-MMT顯著增加了42日齡 肉仔雞法氏囊指數(shù)(P<0.05)。

表2 目的基因及內(nèi)參基因引物

表3 Zn-MMT對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

2.4 Zn-MMT對(duì)肉雞腸形態(tài)的影響

Zn-MMT對(duì)肉雞腸形態(tài)的影響見表6。由表6可知，添加Zn-MMT可以顯著影響十二指腸、空腸、回腸VH、CD及V/C(P<0.05)。相比CK與ZnSO4組，添加40 mg·kg-1的Zn-MMT可以顯著提高十二指腸、空腸的VH和V/C(P<0.05)，且顯著降低十二指腸的CD(P<0.05)，但對(duì)回腸的CD無顯著影響(P>0.05)。同時(shí)，相比CK，40 mg·kg-1的Zn-MMT顯著提高回腸的VH和V/C(P<0.05)，但與ZnSO4組無顯著差異(P>0.05)。同時(shí)，相比CK，添加ZnSO4對(duì)肉仔雞十二指腸、空腸VH、CD及V/C及回腸的VH、CD無顯著影響(P>0.05)，但能顯著提高回腸的V/C(P<0.05)。

2.5 Zn-MMT對(duì)肉雞脾基因(IL-2、TNF-α、IgG、IgA)表達(dá)的影響

Zn-MMT對(duì)肉雞脾IL-2、TNF-α、IgG、IgA基因表達(dá)的影響見表7。由表7可知，Zn-MMT顯著影響肉雞脾IL-2、TNF-α、IgG、IgA基因的表達(dá)(P<0.05)。 相比CK和ZnSO4組，20 mg·kg-1的Zn-MMT顯著提高脾TNF-α表達(dá)，且40、60和80 mg·kg-1的顯著提高脾IL-2的表達(dá)(P<0.05)，而ZnSO4組與CK差異不顯著(P>0.05)。同時(shí)，相比CK，添加ZnSO4和20與40 mg·kg-1的Zn-MMT 顯著提高脾IgG的表達(dá)(P<0.05)，相比CK和Zn-MMT組，ZnSO4顯著提高脾IgA的表達(dá)(P>0.05)。

表4 Zn-MMT對(duì)肉雞屠宰性能的影響

表5 Zn-MMT對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

表6 Zn-MMT對(duì)肉雞腸形態(tài)的影響

表7 Zn-MMT對(duì)肉雞脾IL-2、TNF-α、IgG、IgA mRNA表達(dá)水平的影響

3 討 論

3.1 Zn-MMT對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

天然硅酸鹽礦土具有無害、無污染的特性，常作飼料添加劑的載體或粘結(jié)劑應(yīng)用在動(dòng)物生產(chǎn)中，其品質(zhì)易受種類、產(chǎn)地、等級(jí)和理化結(jié)構(gòu)的影響[6,14]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于硅酸鹽黏土在反芻動(dòng)物、家禽及魚飼料的研究中發(fā)現(xiàn)，其具有抗腹瀉、抗炎、促生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率的優(yōu)點(diǎn)[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，Cu-MMT[18]可顯著降低肥育豬料重及全程料重比，且雙季銨鹽改性蒙脫石與Cu-MMT均能促進(jìn)肉雞生產(chǎn)[19]。Ke等[20]在飼料中添加改性蒙脫石替代金霉素可顯著提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能；Hu等[21]在仔豬日糧中添加蒙脫石和ZnO，均能改善豬生長(zhǎng)性能。本研究發(fā)現(xiàn)，40 mg·kg-1Zn-MMT可顯著降低肉雞的料重比，提高飼料轉(zhuǎn)化率，這與在肉雞日糧中添加ZnO-MMT[22]和Ca-MMT[23]降低料重比的結(jié)果一致。Zn-MMT提高飼料轉(zhuǎn)化率可能與硅酸鹽黏土載體富集鋅,使鋅在動(dòng)物腸道內(nèi)能合理釋放,減少日糧中植酸、纖維等成分對(duì)鋅的螯合,降低抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)鋅的干擾，降低腸道內(nèi)食糜通過率，增加腸道消化酶活性，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[24-25]及腸道發(fā)育有關(guān)。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，80 mg·kg-1Zn-MMT可降低肉雞ADG。這與羅有文[8]在肉雞飼糧中添加40或80 mg·kg-1載鋅凹凸棒石后顯著提高肉雞的增重結(jié)果不一致。這可能與載鋅蒙脫石特殊的結(jié)構(gòu)和理化特性有關(guān)，且添加超過一定劑量時(shí)，可能在腸道中黏結(jié)聚合大型復(fù)合離子、在動(dòng)物體內(nèi)和其他動(dòng)物體所需要的陽離子發(fā)生交換吸附, 影響其他礦物元素及有機(jī)分子的利用[19，26],且載鋅蒙脫石鋅的生物學(xué)活性受其鋅負(fù)載量、制備工藝影響。

3.2 Zn-MMT對(duì)肉雞屠宰性能的影響

相關(guān)研究顯示[27-28]，在飼料中添加斜發(fā)沸石對(duì)生長(zhǎng)豬、育肥豬、肉雞的胴體品質(zhì)和凈胴體重?zé)o顯著影響，但能夠增加肉的產(chǎn)量,提高其腿肌質(zhì)量。王芳等[29]與Qin等[1]研究表明，天然和改性蒙脫石及不同濃度的ZnSO4對(duì)肉雞屠宰性能無顯著影響。也有研究發(fā)現(xiàn)，載鋅凹凸棒石可以提高肉雞全凈膛率、胸肌率和腿肌率,改善屠宰性能[30]，然而，本研究發(fā)現(xiàn)，相比CK，添加Zn-MMT與ZnSO4對(duì)肉雞屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腹脂率、腿比率及腿肌率無顯著影響，這可能與試驗(yàn)中所用載鋅蒙脫石的種類、載鋅蒙脫石的制備工藝、肉雞的飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。此外，黏土礦物在動(dòng)物生產(chǎn)中主要用來吸附霉菌毒素、重金屬、細(xì)菌、病毒，預(yù)防腹瀉和動(dòng)物疾病產(chǎn)生，對(duì)胴體重的促進(jìn)效果不顯著[27]。但相比ZnSO4與60和 80 mg·kg-1Zn-MMT組，添加40 mg·kg-1的Zn-MMT顯著提高了42日齡的胸肌率，與不同劑量的載鋅蒙脫石影響腸道發(fā)育，及ZnSO4與Zn-MMT吸收機(jī)制存在差異有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.3 Zn-MMT對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

鋅是動(dòng)物必需微量元素之一，與動(dòng)物的免疫功能密切相關(guān)，并直接影響胸腺、法氏囊的發(fā)育和成熟，缺鋅會(huì)引起免疫器官萎縮，補(bǔ)鋅后免疫器官的機(jī)能有所恢復(fù)[8,25,31]。免疫器官參與畜禽全身的細(xì)胞免疫和體液免疫[32]，脾是機(jī)體最大的免疫器官，并作為機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心[33]，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能。硅酸鹽黏土通過吸附和清除干擾機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的激素、毒素、病毒、酵母菌、真菌等，增加巨噬細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[15,34]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加60 mg·kg-1Zn-MMT可顯著提高肉雞法氏囊指數(shù)，這與羅有文[8]研究中日糧中添加載鋅凹土促進(jìn)肉雞免疫器官發(fā)育，提高肉雞法氏囊指數(shù)的結(jié)果相一致。同時(shí)，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，40 mg·kg-1Zn-MMT相比ZnSO4顯著提高了42日齡肉雞胸腺指數(shù)。這可能與硅酸鹽黏土獨(dú)特的吸附性和解吸附性相關(guān)，載鋅蒙脫石中鋅離子的釋放受機(jī)體消化道中鋅離子濃度影響，當(dāng)機(jī)體消化道中鋅離子濃度較高時(shí)釋放減緩，若鋅離子濃度降低，則鋅離子的釋放速度增快，從而提高胸腺激素發(fā)揮功能必需依賴鋅離子的利用率[8,35]，使Zn-MMT組中鋅利用率高于ZnSO4組，促進(jìn)胸腺發(fā)育，改善肉雞免疫性能。

3.4 Zn-MMT對(duì)肉雞小腸形態(tài)的影響

腸道是動(dòng)物的主要消化器官，腸道絨毛高度、隱窩深度及其二者比值是反映腸道結(jié)構(gòu)完整性的重要指標(biāo)[36-37]，當(dāng)內(nèi)源性與外源性細(xì)菌、病毒入侵時(shí)，腸道屏障會(huì)保護(hù)機(jī)體免受外界損傷。鋅參與多種酶的重要組成部分，與腸道發(fā)育密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，ZnSO4和甘氨酸鋅能顯著增加腸道絨毛高度[38]；Cu-MMT能顯著提高肉雞空腸VH及V/C；Ca-MMT可緩解AFB1誘發(fā)的肉鴨腸黏膜損傷，提高絨毛高度及V/C[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加40 mg·kg-1的Zn-MMT可以顯著提高十二指腸、空腸的VH和V/C，且顯著降低十二指腸的CD，這與Xia等[7]發(fā)現(xiàn)改性蒙脫石可提高空腸空腸的VH和V/C相一致。小腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度增大，降低隱窩深度，可增強(qiáng)絨毛上皮細(xì)胞再生能力，增加小腸與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，直接影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育與飼料轉(zhuǎn)化率[39-40]。同時(shí)，載鋅蒙脫石在肉雞腸道內(nèi)持續(xù)釋放鋅及硅酸鹽黏土吸附或抑制腸道細(xì)菌、霉菌毒素等，緩解其對(duì)腸上皮細(xì)胞造成的損傷，增強(qiáng)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖及黏膜分泌，促進(jìn)腸絨毛發(fā)育，維持腸道形態(tài)[16,25,41-42]。

3.5 Zn-MMT對(duì)肉雞脾基因表達(dá)的影響

動(dòng)物機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)包括體液免疫和細(xì)胞免疫,體液免疫主要由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體來介導(dǎo),細(xì)胞免疫主要由T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子來介導(dǎo)，包括白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子[43-44]；其中IL-2被認(rèn)為是T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，并由激活的T細(xì)胞分泌[45]；TNF-α是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生的單核因子，在炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[46]。本研究發(fā)現(xiàn)，Zn-MMT能提高脾TNF-α、IL-2及IgG的表達(dá)，ZnSO4顯著提高脾IgA的表達(dá)。這可能與鋁硅酸鹽促進(jìn)脾中負(fù)責(zé)免疫球蛋白合成的B淋巴細(xì)胞分化，提高免疫球蛋白的含量[47]，刺激細(xì)胞因子釋放，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

4 結(jié) 論

肉雞玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧中添加40 mg·kg-1的Zn-MMT促進(jìn)脾IL-2、IgG基因的表達(dá)，并顯著提高十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度并降低十二指腸的隱窩深度，增強(qiáng)絨毛上皮細(xì)胞再生能力及營(yíng)養(yǎng)接觸面積，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率。添加40 mg·kg-1ZnSO4可顯著改善十二指腸、空腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度并降低十二指腸的隱窩深度，能夠促進(jìn)腸道發(fā)育。