黃思藝，喬 蕾，何莉娜，王 磊，李碧筠，陳俊材，趙中權(quán)

(西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

哺乳動(dòng)物支持細(xì)胞的增殖在出生后可以分為兩個(gè)階段，即出生期前后和青春期前，幼年睪丸最初的增長(zhǎng)比生物體慢，之后隨著青春期的臨近其增長(zhǎng)速度比生物體快。睪丸在這一時(shí)期的變化包括曲細(xì)精管直徑的增大、間質(zhì)空間的縮小以及曲細(xì)精管長(zhǎng)度的增大，但這些發(fā)育變化并不一定是以相同的速度發(fā)生[1-2]，牛支持細(xì)胞數(shù)量呈線性增加，表明在牛體內(nèi)不存在分離為兩個(gè)不同的出生后波的現(xiàn)象，這推翻了哺乳動(dòng)物(實(shí)驗(yàn)室小鼠和大鼠除外) 產(chǎn)后支持細(xì)胞增殖存在兩個(gè)階段的理論[3]。而公羊與牛相似，支持細(xì)胞的數(shù)量在出生后表現(xiàn)出相似的線性增長(zhǎng)[4]。由于睪丸支持細(xì)胞在青春期前停止分裂，此后支持細(xì)胞群體變得穩(wěn)定，且支持細(xì)胞只能支持有限數(shù)量的生殖細(xì)胞，故雄性哺乳動(dòng)物在青春期前建立的支持細(xì)胞數(shù)量決定了最終性成熟后的睪丸大小和精子數(shù)量[5]。因此，影響支持細(xì)胞發(fā)育和增殖能力的因素也可能對(duì)成年動(dòng)物睪丸功能產(chǎn)生重要影響。

體內(nèi)多種激素會(huì)影響睪丸支持細(xì)胞的增殖。其中關(guān)于促卵泡素、甲狀腺激素和睪酮等激素可刺激睪丸支持細(xì)胞增殖的報(bào)道居多。例如，促卵泡素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)在精子細(xì)胞代謝和精子形成中起重要作用，被認(rèn)為是睪丸支持細(xì)胞分裂的主要有絲分裂因子[6-8]；而且，外源性的FSH給藥能夠增加精子發(fā)生速率，有利于治愈男性不育癥[9]。甲狀腺激素受體在睪丸發(fā)育過(guò)程中高度表達(dá)，但在成年睪丸中不表達(dá)，它可以延長(zhǎng)睪丸支持細(xì)胞有絲分裂時(shí)間，誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞的早期成熟，從而改變成年動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞的總數(shù)[10-12]。睪酮是由睪丸中的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的，可以與雄激素受體結(jié)合，調(diào)節(jié)睪丸支持細(xì)胞的合成和分泌[13-14]。這些研究都說(shuō)明，睪丸支持細(xì)胞的增殖受到了體內(nèi)多種激素的調(diào)控。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein，BMP4)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族的成員，在兩性繁殖方面起著重要的作用，其表達(dá)與卵細(xì)胞的活力和功能、精子質(zhì)量和胚胎發(fā)育有關(guān)。研究表明，BMP4突變型雄性小鼠不育，存在生殖細(xì)胞退化、精子計(jì)數(shù)低、精子質(zhì)量差等問(wèn)題[15]。在雌性哺乳動(dòng)物中，BMP4促進(jìn)催乳素細(xì)胞的產(chǎn)生，并與Smad(Sma and Mad homologue)-雌激素受體(estrogen receptor，ER)相互作用以促進(jìn)泌乳素的產(chǎn)生，其作用機(jī)制表現(xiàn)為BMP4抑制ER的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而減弱SMAD信號(hào)的表達(dá)[16-17]。DNA結(jié)合抑制劑(Id)屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋因子的內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)劑，可通過(guò)防止異二聚體與DNA結(jié)合來(lái)抑制細(xì)胞分化，促進(jìn)增殖，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的自我更新和再生[18-20]。Id家族成員的DNA結(jié)合抑制劑2(Id2)是BMP目標(biāo)基因中最重要的成員，作為BMP4的下游基因參與BMP4誘導(dǎo)的細(xì)胞功能改變[21]。本研究著重于BMP4-Id2信號(hào)軸，探討其在睪丸支持細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

試驗(yàn)動(dòng)物選自西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)羊場(chǎng)的健康大足黑山羊，4組山羊分別為0、1、2和3月齡， 每組選擇3只公山羊。所有試驗(yàn)均得到西南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

山羊麻醉后，立即用消毒的外科手術(shù)設(shè)備收集睪丸組織，酒精消毒，將它們放入含有雙抗的生理鹽水中，立即送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。使用十字法切開(kāi)睪丸的白膜以及附睪，以暴露睪丸中間的實(shí)質(zhì)組織，并將其放入新的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，切成約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，使其均勻。兩步酶法消化勻漿，將含有DMEM/F12的混合物通過(guò)80目和400目細(xì)胞篩過(guò)濾到燒杯中，以獲得單細(xì)胞懸液，將其以1 300 r·min-1離心5 min獲得細(xì)胞沉淀。最后，向細(xì)胞沉淀物中添加適量的胎血培養(yǎng)基，移液混合，添加到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度。調(diào)整到燒瓶底部的約60%，并標(biāo)記每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。置于37 ℃ 和5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在2、12、18和24 h后更換培養(yǎng)基，以去除未附著的精原細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和雜質(zhì)細(xì)胞。

1.2 BMP4下游靶基因的預(yù)測(cè)

本課題組前期對(duì)大足黑山羊睪丸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，其結(jié)果的準(zhǔn)確性已經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)[22]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，BMP4與BMPRⅠ結(jié)合，使SMAD4參與磷酸化SMAD1、SMAD5、SMAD8，并最終調(diào)控Id家族基因，從而影響DNA的復(fù)制。通過(guò)初步的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，山羊睪丸支持細(xì)胞中Id1和Id3基因的表達(dá)水平極低。因此，本試驗(yàn)選擇Id2基因作為研究對(duì)象。

1.3 貼壁細(xì)胞總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用RNAiso試劑(TaKaRa，中國(guó))從細(xì)胞中提取總RNA。使用型號(hào)Nanodrop1000分光光度計(jì)(中國(guó))測(cè)定RNA濃度和純度。研究中僅考慮吸光度比A260/A280為1.8～2.0的樣品。根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書(shū)的要求首先去除基因組DNA，之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.4 山羊睪丸支持細(xì)胞總蛋白提取和Western blotting

根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用動(dòng)物總蛋白提取試劑盒(Sangon Biotech，中國(guó))提取山羊睪丸支持細(xì)胞的總蛋白，BCA法測(cè)量蛋白水平。通過(guò)電泳、轉(zhuǎn)印、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯影等步驟測(cè)定對(duì)應(yīng)抗體的相對(duì)表達(dá)量水平。

1.5 引物設(shè)計(jì)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

所有基因擴(kuò)增引物均使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)設(shè)計(jì)(表1)，委托重慶擎科生物有限公司合成。TB Green?Premix Ex TaqTMII熒光定量PCR的反應(yīng)體系為15 μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 7.5 μL，F(xiàn)orward primer 0.3 μL，Reverse primer 0.3 μL，cDNA 0.6 μL，RNase Free H2O 6.3 μL。 反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；63.5 ℃檢測(cè)信號(hào)，熔解曲線根據(jù)引物不同設(shè)置為65～95 ℃每0.5 ℃讀取一次Ct 值。

表1 研究中使用的PCR引物序列

1.6 質(zhì)粒構(gòu)建和基因干擾片段

用于過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒載體是pReceiver-07-Expression Clone(圖1)，使用的標(biāo)簽抗體是血凝素(HA)。

BMP4干擾片段：BMP4(goat)-si-1: GAGCCAUGCUAGUUUGAUAtt；BMP4(goat)-si-2：GCAGGGCUUUCAUCGUAUAtt；BMP4(goat)-si-3：GCCCGGAAGAAGAAUAAGA tt。Id2干擾片段：Id2(goat)-si-1：GCCUGCUGUACAACA-UGAAtt；Id2(goat)-si-2：GGCUUCUGAAUU-CCCUUCUtt；Id2(goat)-si-3：GCAAGAUGGAA-AUCCUGCAtt。

1.7 睪丸支持細(xì)胞免疫熒光鑒定

將單細(xì)胞懸浮液加入放有細(xì)胞爬片的12孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用無(wú)菌的PBS沖洗3次。4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，0.5%Triton X-100溶液進(jìn)行細(xì)胞通透，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，5% 的BSA溶液封閉后，孵育一抗(Rabbit Anti-WT1，Rabbit Anti-PCNA)、二抗(山羊抗兔IgG)，再用DAPI進(jìn)行核染，DAB對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行顯色。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有qPCR數(shù)據(jù)均表示為“平均值±SEM”，用2-ΔΔCT法測(cè)定基因的相對(duì)表達(dá)水平。使用SPSS 19.0軟件單因素方差One-Way ANOVA分析對(duì)多個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，使用獨(dú)立t檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。每個(gè)選擇鑒定的基因均進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)以及3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 睪丸支持細(xì)胞鑒定

WT1蛋白(wilms tumor protein-1)在睪丸支持細(xì)胞中特異性表達(dá)，而在睪丸其他細(xì)胞中不表達(dá)，因此WT1蛋白表達(dá)可作為鑒定睪丸支持細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)[23]。培養(yǎng)細(xì)胞的DAPI核染色和WT1蛋白的AlexaFluor647紅色熒光標(biāo)記顯示，幾乎100%的細(xì)胞核被染成紅色，表明大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞是睪丸支持細(xì)胞，可用于后續(xù)試驗(yàn)(圖2)。

2.2 BMP4在各年齡階段睪丸支持細(xì)胞中的表達(dá)

為篩選出睪丸支持細(xì)胞中BMP4表達(dá)最高的時(shí)期，使用qPCR來(lái)檢測(cè)BMP4在0、1、2和3月齡時(shí)期睪丸支持細(xì)胞中的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)0～3月齡的睪丸支持細(xì)胞中都存在BMP4表達(dá)，并且BMP4在2月齡 組的表達(dá)量極顯著高于0、1月齡組(P<0.01，圖3)。因此，使用2月齡的睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 不同濃度BMP4對(duì)睪丸支持細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞復(fù)蘇后接種到96孔板，按分組向不同的孔中加入不同濃度的BMP4。具體分組設(shè)置為對(duì)照組、50、100、150和200 ng·mL-1組(每組4個(gè)重復(fù)孔)。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72 h。CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h后細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化，48、72 h后細(xì)胞隨BMP4濃度的增加其增殖活力也增加。其中200 ng·mL-1的BMP4處理組與對(duì)照組相比，其增殖能力最強(qiáng)(P<0.05，圖4)。

2.4 BMP4干擾效果檢測(cè)

為深入了解BMP4表達(dá)水平對(duì)睪丸支持細(xì)胞的影響，本研究用RT-PCR檢測(cè)干擾片段對(duì)BMP4表達(dá)的影響。結(jié)果表明，陰性對(duì)照(NC)對(duì)BMP4基因表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)，而3對(duì)干擾片段對(duì)BMP4基因表達(dá)均有一定的干擾作用，干擾效率分別為67.85%、73.44%和64.05%(P<0.01，圖5A)，其中，BMP4 siRNA2具有最高的干擾效率，被選作后續(xù)試驗(yàn)的干擾片段。利用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的活性，結(jié)果表明，與NC組相比，siRNA2組的細(xì)胞活力分別在24和48 h后下降了21%和34%(P<0.05)， 并在72 h后恢復(fù)，NC和siRNA組之間無(wú)顯著差異(P>0.05，圖5B)。在睪丸支持細(xì)胞中，BMP4干擾后，試驗(yàn)組中PCNA的表達(dá)極顯著降低(P<0.01，圖5C)，表明BMP4干擾后細(xì)胞的增殖能力受到限制。測(cè)量細(xì)胞增殖指數(shù)表明，與NC組相比，BMP4干擾組的增殖水平顯著降低(P<0.05， 圖5D)，進(jìn)一步說(shuō)明BMP4干擾后細(xì)胞的增殖能力受到限制。

2.5 BMP4敲低/過(guò)表達(dá)對(duì)Id2的影響

為驗(yàn)證BMP4對(duì)Id2的作用，本研究敲低了BMP4或使其過(guò)表達(dá)。敲低BMP4后，試驗(yàn)組其下游靶基因Id2的mRNA水平較NC組降低，但無(wú)顯著差異(P>0.05，圖6A)，因此沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。BMP4過(guò)表達(dá)后，試驗(yàn)組BMP4的表達(dá)水平極顯著高于NC組和對(duì)照組(P<0.01,圖6B)。使用HA標(biāo)簽確定了BMP4過(guò)表達(dá)后Id2的蛋白水平，并使用qPCR檢測(cè)了Id2的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，BMP4過(guò)表達(dá)后，不僅其自身表達(dá)增加，而且其靶基因Id2也顯著增加，并且過(guò)表達(dá)組中Id2的表達(dá)比NC組高1.25倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6C、D、E)。這些結(jié)果表明，BMP4對(duì)Id2有正向的調(diào)節(jié)作用。

2.6 干擾Id2對(duì)睪丸支持細(xì)胞增殖的影響

為篩選出對(duì)Id2干擾效果最佳的siRNA，將3個(gè) 干擾片段分別轉(zhuǎn)染睪丸支持細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，Id2-siRNA2的干擾效率最高，為77.72%(P<0.01，圖7A)。因此，選擇Id2-siRNA2進(jìn)行后續(xù)研究。為驗(yàn)證Id2干擾對(duì)睪丸支持細(xì)胞增殖基因表達(dá)的影響，首先過(guò)表達(dá)BMP4，然后將Id2干擾片段轉(zhuǎn)染24 h，最后提取總RNA，利用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)PCNA的表達(dá)。對(duì)熒光定量結(jié)果分析表明，單獨(dú)過(guò)表達(dá)BMP4后，PCNA的表達(dá)較對(duì)照組極顯著增加(P<0.01)。BMP4過(guò)表達(dá)再轉(zhuǎn)染Id2干擾片段后，PCNA的表達(dá)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 單獨(dú)干擾Id2組PCNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05，圖7B、C)。

3 討 論

BMP4對(duì)兩性的生殖功能都有重要影響，其表達(dá)會(huì)影響精子的健康、卵細(xì)胞的活力和功能以及正常的胚胎發(fā)育[24]。本試驗(yàn)首先篩選出了BMP4在大足黑山羊睪丸支持細(xì)胞中作用的最佳年齡。BMP4的表達(dá)在2月齡組最高，這可能與大足黑山羊的生殖發(fā)育階段有關(guān)，2月齡正處于青春期前期，睪丸的發(fā)育處于旺盛階段，睪丸體積增大，支持細(xì)胞也處于大幅度增長(zhǎng)狀態(tài)[25]?；谶@種推測(cè)，本研究探討了BMP4濃度對(duì)睪丸支持細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響，發(fā)現(xiàn)睪丸支持細(xì)胞的增殖能力隨著B(niǎo)MP4濃度的增加而增加，這種狀態(tài)與細(xì)胞接觸異質(zhì)后的生長(zhǎng)趨勢(shì)相一致。同樣，Hai等[26]發(fā)現(xiàn)，BMP4能使人睪丸支持細(xì)胞的生長(zhǎng)呈劑量依賴(lài)性。隨后，為驗(yàn)證此結(jié)果，本研究構(gòu)建了3條siRNA干擾片段，經(jīng)過(guò)熒光檢測(cè)證實(shí)，siRNA能夠被有效地轉(zhuǎn)入到睪丸支持細(xì)胞內(nèi)，且siRNA2干擾效率最高，可以作為BMP4的干擾靶點(diǎn)。

Id的生理功能主要是抑制細(xì)胞分化和促進(jìn)細(xì)胞增殖。Yang等[27]表明，Id蛋白是人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵下游效應(yīng)子，F(xiàn)ei等[28]發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎干細(xì)胞中，Id基因的啟動(dòng)子區(qū)域有SMAD的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步表明BMP /SMAD途徑可以通過(guò)Id基因起作用。在本研究中，干擾BMP4后，睪丸支持細(xì)胞中Id2表達(dá)水平無(wú)明顯變化；而在BMP4過(guò)表達(dá)后，睪丸支持細(xì)胞中Id2的表達(dá)水平顯著上升，表明在睪丸支持細(xì)胞中BMP4能夠正向調(diào)控Id2。相對(duì)過(guò)表達(dá)BMP4再干擾Id2試驗(yàn)組，干擾Id2的試驗(yàn)組中PCNA基因以及蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，這說(shuō)明BMP4可以通過(guò)Id2影響支持細(xì)胞的增殖。這與Hua等[29]發(fā)現(xiàn)的BMP4 通過(guò)Id2蛋白促進(jìn)胰腺祖細(xì)胞增殖的結(jié)果是相似的。但過(guò)表達(dá)BMP4再干擾Id2的試驗(yàn)組PCNA表達(dá)水平與對(duì)照組差異不顯著，而只干擾Id2試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明BMP4可能不僅僅通過(guò)Id2這一基因?qū)ΣG丸支持細(xì)胞起作用，如作為BMPs主要調(diào)控通路的SMAD通路很有可能在其中起著重要作用[30-31]。這些結(jié)果與Carlomagno等[32]對(duì)小鼠精原干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是相似的。但是，Id2下游是否存在調(diào)控睪丸支持細(xì)胞生長(zhǎng)的基因需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，山羊睪丸支持細(xì)胞的增殖活力在一定范圍內(nèi)與BMP4的濃度呈正相關(guān)；且BMP4能夠正向調(diào)控Id2的表達(dá)，并通過(guò)促進(jìn)Id2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)支持細(xì)胞的增殖。