易正飛，張耀東，王 瑤，2，朱 紅，陶程琳，3，AFAYIBO Dossêh Jean Aptre，李 濤，祁晶晶，田明星，丁 鏟，于圣青*，王少輝*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241； 2.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041； 3.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009)

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicE.coli，APEC)可感染禽類，表現(xiàn)多種不同癥狀的大腸桿菌病，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。另外，APEC屬于腸道外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenicE.coli, ExPEC)，與人源ExPEC中新生兒腦膜炎大腸桿菌(neonatal meningitisE.coli, NMEC)和尿道致病性大腸桿菌(uropathogenicE.coli, UPEC)的基因組結構、遺傳進化和生態(tài)分布高度相似，且具有類似的毒力因子和致病機制[1-3]。由于抗生素的不合理使用，APEC的耐藥性日趨嚴重。因此，APEC被認為是人源ExPEC毒力基因和耐藥基因的貯庫，具有重要的公共衛(wèi)生意義[4]。

病原菌通過復雜的調(diào)控網(wǎng)絡控制基因適時表達，從而適應環(huán)境、促進生存及感染。其中，雙組分系統(tǒng)(two component system, TCS)廣泛存在于細菌中并參與感知響應環(huán)境變化及促進致病性。典型的TCS通常包含位于細菌膜的組氨酸激酶(histidine kinase, HK)感受元件和存在于細胞質(zhì)中的應答調(diào)控(response regulator, RR)元件兩部分[5]。另外，一些TCS還含有額外的調(diào)控輔助蛋白，在蛋白磷酸化等過程發(fā)揮作用。HK感受元件能夠感應各種環(huán)境信號變化，然后通過磷酸化激活RR并調(diào)控靶基因的轉錄表達，從而改變細菌能量代謝、壓力應激等以適應環(huán)境[6-9]。CpxA/CpxR是典型的TCS，其中，組氨酸蛋白激酶CpxA作為感受元件將外界信號傳遞給CpxR發(fā)揮轉錄調(diào)控功能[10]。Cpx最早被證實主要在維持細菌膜結構蛋白的正確折疊和組裝過程中發(fā)揮作用[11]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Cpx TCS可以感知細菌膜表面壓力變化信號，調(diào)控細菌的多種毒力因子，如菌毛、分泌系統(tǒng)，從而有助于細菌快速適應環(huán)境，進而參與調(diào)控不同細菌的耐藥性、抵抗力和毒力[12-15]。

為了探討Cpx TCS的應答調(diào)控元件CpxR對APEC生物學特性和毒力的影響，本文構建了Cpx TCS應答調(diào)控元件編碼基因cpxR缺失株和基因互補株，比較分析了APEC菌株的生長速度、運動能力、生物被膜形成能力、藥物敏感性和抗血清殺菌能力和毒力，為深入研究APEC的致病機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和實驗動物

O2血清型APEC菌株DE719由本實驗室分離鑒定，對雞、鴨及小鼠具有致病性[16]；大腸桿菌DH5α購自天根(北京)生化科技有限公司。Red同源重組系統(tǒng)質(zhì)粒pKD46、pKD3、pCP20由本實驗室保存；低拷貝互補質(zhì)粒pSTV28購自寶生物工程(大連)有限公司。1日齡櫻桃谷鴨購自江蘇省江陰市某養(yǎng)鴨合作社。

1.2 主要試劑與儀器

質(zhì)粒提取試劑盒購自天根(北京)生化科技有限公司；PrimeSTAR Mix、DNA Ligation Mix、限制性核酸內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA Marker購自諾維贊生物科技有限公司；L-阿拉伯糖購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。PCR儀購自ABI公司；電轉化儀購自Bio-Rad公司；電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.3 引物設計

根據(jù)APEC DE719菌株cpxR及其上下游基因序列，設計cpxR基因缺失引物、鑒定引物及互補引物(表1)，由上海睿勉生物科技有限公司合成。

表1 本研究使用的引物

1.4 cpxR基因缺失株及互補株的構建

根據(jù)Red同源重組系統(tǒng)方法[17]，構建DE719菌株的cpxR基因缺失株。以pKD3質(zhì)粒為模板，cpxRMu-F/R為引物，擴增cpxR基因打靶片段。將cpxR基因打靶片段電轉化入DE719-pKD46感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆，分別以缺失鑒定引物進行PCR及測序鑒定cpxR基因缺失株。然后通過輔助性質(zhì)粒pCP20去除氯霉素抗性片段，鑒定正確的cpxR基因缺失株，命名為ΔcpxR。PCR擴增cpxR基因及其啟動子序列，克隆至pSTV28構建互補質(zhì)粒pSTV28-cpxR，電轉化入缺失株ΔcpxR中，獲得互補株CΔcpxR。

1.5 生長曲線與運動性測定

將新鮮菌液DE719、ΔcpxR、CΔcpxR培養(yǎng)至OD600 nm=1，按照1∶100的比例接種至200 mL LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃，200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取樣測定OD600 nm值，繪制生長曲線。將上述菌株培養(yǎng)至OD600 nm=1，取5 μL菌液點樣于0.5%瓊脂LB平板，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，測定菌圈直徑，比較不同菌株的運動能力。

1.6 生物被膜形成能力測定

將新鮮菌液稀釋至OD600 nm=0.1，每孔200 μL加入到96孔細胞板中，LB培養(yǎng)基作為陰性對照，37 ℃ 靜止培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS洗3次 后加入200 μL結晶紫溶液染色30 min，再以無菌PBS洗滌5次，自然風干后加入200 μL 95%乙醇充分溶解，測定OD595 nm值。

1.7 最小抑菌濃度(MIC)測定

研究表明，Cpx TCS有助于尿道致病性大腸桿菌、沙門菌對卡那霉素和阿米卡星的耐受性[13, 15, 18-19]。因此，本研究根據(jù)CLSI-2018微量肉湯稀釋法[20]，分析APEC對卡那霉素和阿米卡星的最小抑菌濃度。將新鮮菌液1∶100倍稀釋，與不同濃度抗生素混勻，37 ℃培養(yǎng)16 h后判讀結果。同時設置不添加抗生素的陽性對照組和LB空白對照組。

1.8 血清殺菌試驗

以預冷PBS洗滌新鮮菌液并重懸，調(diào)整濃度為108CFU·mL-1，取10 μL菌懸液與190 μL不同濃度SPF雞血清(100%、50%、25%)混合，對照組為熱滅活SPF雞血清。37 ℃孵育30 min后倍比稀釋，涂布LB平板，統(tǒng)計存活細菌數(shù)。

1.9 半數(shù)致死量(LD50)測定

收集對數(shù)生長期細菌，無菌PBS洗滌2次，重懸。分別以1×107、1×106、1×105、1×104、1×103CFU·只-1劑量感染7日齡櫻桃谷鴨，每組8只， 連續(xù)觀察7 d，記錄發(fā)病及死亡情況，根據(jù)改良寇氏法計算半數(shù)致死量(LD50)。

2 結 果

2.1 cpxR 基因缺失株及互補株鑒定

分別以缺失株內(nèi)側鑒定引物和外側鑒定引物對cpxR基因缺失株、互補株進行PCR檢測。如圖1所示，內(nèi)側引物鑒定時，野生株和互補株可擴增出458 bp的cpxR基因目的條帶，而缺失株無cpxR基因條帶；外側引物鑒定時，野生株擴增片段大小為1 032 bp，而cpxR基因缺失株、互補株擴增片段大小為333 bp目的條帶。PCR檢測及測序結果表明，cpxR基因缺失株及互補株構建成功。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1、4. 野生株DE719；2、5. 缺失株ΔcpxR；3、6. 互補株CΔcpxRLane M. DNA marker; Lane 1, 4. Wild-type strain DE719; Lane 2, 5. Mutant strain ΔcpxR; Lane 3, 6. Complemented strain CΔcpxR圖1 野生株、缺失株和互補株的PCR鑒定Fig.1 Identification of wild-type, mutant and complemented strains

2.2 生長曲線與運動能力測定

生長曲線和運動能力測定結果顯示，DE719、ΔcpxR和CΔcpxR的生長速度和運動性趨于一致，無明顯差異(圖2)，表明CpxR不影響APEC的生長速度和運動能力。

A. 生長曲線；B. 不同菌株在0.5%瓊脂上的運動直徑A. Growth curves; B. Motility diameter of each strains on 0.5% LB agar圖2 APEC生長曲線和運動能力Fig.2 Growth curves and motility assays of APEC

2.3 生物被膜形成能力

生物被膜形成能力測定顯示，缺失株ΔcpxR的生物被膜形成能力略有下降，分別為野生株DE719、互補株CΔcpxR的91.5%和96.7%，但無顯著性差異(P>0.05，圖3)，表明CpxR不影響APEC的生物被膜形成能力。

2.4 藥物敏感性

微量肉湯稀釋法結果顯示DE719、ΔcpxR和CΔcpxR對卡那霉素的MIC分別為30、20、50 μg·mL-1； 對阿米卡星的最小抑菌濃度分別為40、20、70 μg·mL-1(表2)。缺失株ΔcpxR對卡那霉素和阿米卡星的敏感性均高于野生株和互補株，表明CpxR有助于降低APEC對卡那霉素和阿米卡星的敏感性。

圖3 生物被膜形成能力測定Fig.3 Determination of biofilm formation ability

表2 APEC菌株的最小抑菌濃度

2.5 抗血清殺菌能力

血清殺菌試驗結果顯示，缺失株ΔcpxR在100%、50%和25%SPF雞血清中存活率均顯著低于野生株(P<0.05)，互補株的存活率恢復至野生株水平。APEC在滅活血清中的存活率均無明顯差異(圖4)。結果表明，CpxR促進APEC的抗血清殺菌能力。

圖4 抗SPF雞血清殺菌能力Fig.4 Resistance to bactericidal activities of SPF chicken serum

2.6 半數(shù)致死量(LD50)測定

雛鴨感染試驗結果顯示，野生株DE719、缺失株ΔcpxR和互補株CΔcpxR的LD50分別為7.50×105、7.50×106、1.33×106CFU·只-1。與野生株相比，缺失株的毒力降低10倍，而互補株的致病力部分恢復。另外，作者前期研究發(fā)現(xiàn)，缺失株ΔcpxR感染組的雛鴨發(fā)病及死亡慢，且其臨床癥狀、病理變化及組織載菌量均低于野生株和互補株感染組雛鴨[21]，表明CpxR有助于APEC的感染及毒力。

表3 禽致病性大腸桿菌的LD50測定

3 討 論

APEC不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，而且作為人類ExPEC的毒力基因及耐藥基因儲庫，嚴重危害人類健康及公共衛(wèi)生安全[22-23]。在感染過程中，APEC需要通過復雜的調(diào)控系統(tǒng)控制基因適時表達，從而抵御機體免疫和環(huán)境壓力的殺傷[13, 15]并致病。TCS廣泛存在于細菌中，其可以感應外界環(huán)境變化，如養(yǎng)分、滲透壓力和抗生素等，通過雙組分蛋白的磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)細胞信號傳導途徑，從而調(diào)控細菌的生理代謝、壓力應激、生物被膜及致病性等方面[5, 7, 9]。研究表明，Cpx TCS可以感知細菌膜表面壓力變化信號，調(diào)控細菌的多種毒力因子適應環(huán)境變化，有利于細菌的生存[24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)CpxR不影響APEC的生長速度、運動能力和生物被膜形成能力。吳同壘等[19]發(fā)現(xiàn)缺失cpxR基因不影響沙門菌的生長速度。另外，在缺失株ΔcpxA中，高水平的磷酸化CpxR可能抑制鞭毛和運動基因的轉錄，而cpxR基因的缺失可能導致這種抑制作用消除，因而ΔcpxR缺失株與野生株相比在運動性和生物被膜形成能力無明顯差異[27]。

沙門菌缺失cpxR基因后，對多種抗菌藥物的敏感性增加，其中，包括阿米卡星和卡那霉素[18-19]。本研究中，缺失cpxR基因導致APEC DE719菌株對阿米卡星和卡那霉素的藥物敏感性增加，表明CpxR有利于APEC的耐藥性。TCS Cpx感知抗生素壓力信號后，調(diào)控病原菌外膜孔道蛋白和外排泵的表達，增強抵御抗生素的殺傷，從而影響細菌對藥物的敏感性[28]。CpxR參與調(diào)控大腸桿菌對氨基糖苷類藥物的敏感性[12, 29]，大腸桿菌的Cpx可影響外膜蛋白OmpC、OmpF及acrD的表達[12, 30]，從而調(diào)控大腸桿菌對氨基糖苷類藥物阿米卡星和卡那霉素的敏感性。

APEC在體內(nèi)定殖后，進入血液循環(huán)引發(fā)全身性感染，從而引起家禽急性死亡，因此抗血清殺菌能力在其生存及致病過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CpxR有助于APEC在血清中的存活能力，與UPEC中CpxR的結果一致[15]。細菌可以利用細胞表面分子或分泌蛋白逃避補體系統(tǒng)的識別，從而抵抗血清的殺傷[31]，但CpxR的抗血清殺菌機制還不明確。動物試驗結果顯示，cpxR基因缺失株對雛鴨的毒力下降約10倍，與其他菌種的CpxR功能相似[32]。其中，cpxR基因缺失株的抗血清殺菌能力降低是導致毒力下降的重要原因之一。另外，CpxR作為調(diào)控因子，通過磷酸化激活后可以結合至靶序列上調(diào)控靶基因的轉錄表達，從而參與細菌能量代謝、壓力應激及毒力等。CpxR可以直接結合菌毛基因fimA啟動子和Ⅵ型分泌系統(tǒng)2hcp2B操縱子序，調(diào)控菌毛和Ⅵ型分泌系統(tǒng)2的表達，從而影響APEC的黏附、菌間競爭能力及體內(nèi)定殖能力及毒力[21, 27]。

總之，本文證實TCS CpxR在APEC對阿米卡星和卡那霉素的耐藥性、抗血清殺菌能力及毒力方面發(fā)揮著重要作用，為進一步研究APEC的環(huán)境適應性及生存能力提供參考，并為篩選抗生素靶標和防控大腸桿菌病提供新的思路。

4 結 論

缺失cpxR基因不影響禽致病性大腸桿菌(APEC)的生物被膜形成能力，但可導致APEC對阿米卡星和卡那霉素耐藥性降低；CpxR有助于APEC的抗血清殺菌能力；CpxR缺失顯著降低APEC的毒力。研究表明，Cpx雙組分系統(tǒng)中的CpxR在APEC耐藥性、抗血清殺菌能力及毒力方面發(fā)揮作用。