戴宏健，呂增鵬，黃振吾，李思夢, 魏全偉，孫 濤，石放雄*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，南京 210095； 2. 山東省德州市陵城區(qū)畜牧獸醫(yī)服務中心，德州 253500)

蛋殼具有抵抗外力破壞和抵御微生物侵害的作用[1-2]，蛋殼品質(zhì)是衡量蛋雞經(jīng)濟性狀的重要指標[3]。集約化生產(chǎn)中，蛋殼品質(zhì)問題日益凸顯[4]，并且在產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)下降等問題越發(fā)嚴峻[5]。這類問題在需要進行人工輸精的種雞生產(chǎn)中尤為突出。蛋殼品質(zhì)下降不僅影響食品質(zhì)量安全，也給蛋雞養(yǎng)殖和種蛋孵化產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，改善蛋殼品質(zhì), 尤其是改善產(chǎn)蛋后期種雞的蛋殼品質(zhì)對于家禽產(chǎn)業(yè)高效發(fā)展尤為重要。

蛋雞日齡是決定蛋殼品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。蛋殼鈣化形成的過程是在輸卵管殼腺部進行的，此過程受雌激素的調(diào)控[6]。然而，老年母雞普遍存在雌激素水平下降的現(xiàn)象。此外，氧化應激是造成機體衰老和功能減退的主要原因之一[7]。研究表明，氧化應激不僅會抑制鈣離子在腸道內(nèi)的吸收[8]，還會阻礙鈣在殼腺部中的轉(zhuǎn)運[9]。殼腺部鈣離子的吸收和轉(zhuǎn)運對蛋殼的形成和品質(zhì)起決定性作用[10-11]。目前，關(guān)于提升蛋殼品質(zhì)的研究主要集中在營養(yǎng)調(diào)控[12-13]和飼養(yǎng)管理[6]等方面，而有關(guān)黃酮類物質(zhì)對殼腺部作用機制的研究鮮有報道。

山楂是一種多年生木本植物，廣泛分布于亞洲、歐洲和美洲。山楂葉已被用于治療心血管和脂肪肝疾病[14]。山楂葉黃酮類化合物是從山楂葉中提取的，具有抗高血壓、抗炎、清除自由基和抗菌等生物學功能[15-16]。據(jù)報道，灌胃山楂葉黃酮類物質(zhì)可以通過激活Nrf2/HO-1信號通路來提高非酒精性肝炎大鼠的抗氧化能力[17]。Shi等[16]研究表明，多囊卵巢綜合征的大鼠口服山楂葉黃酮(HF)后可顯著提高機體的雌激素水平和抗氧化能力。因此，本研究擬從抗氧化和鈣轉(zhuǎn)運角度探究HF對種雞蛋殼品質(zhì)調(diào)控的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養(yǎng)管理

山楂葉黃酮由南通經(jīng)緯生物科技有限公司提供，純度80%(牡荊素鼠李糖苷 48%、牡荊素葡萄糖苷 12%、牡荊素 8%、金絲桃苷 6%等)。選擇體重和產(chǎn)蛋率相近的60周齡健康種母雞(棲嶺草雞)270只，隨機分為3組，每組6個重復，每個重復15只。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(CON)；低、高劑量試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加30(LHF)和60 mg·kg-1(HHF)的HF。基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1994)和我國《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)，組成和營養(yǎng)水平見表1。

動物試驗在常州土山種雞場進行。采用半開放式雞舍階梯式籠養(yǎng), 每籠 (47 cm×37 cm×47 cm) 3只雞，連續(xù)5籠為1個重復，每組6個重復均勻分布在雞舍內(nèi)。預飼期為2周，期間統(tǒng)一飼喂對照組基礎(chǔ)日糧，根據(jù)生產(chǎn)性能進行適當調(diào)整后，進行為期8周的正式試驗。自然光照加人工補光, 光照時間為16 h·d-1、溫度保持在18～25 ℃，縱向負壓通風。每天定時(06:00)飼喂1次，限飼113 g·d-1，自由飲水；每天15：00按照標準程序由指定的專業(yè)人員統(tǒng)一進行人工輸精，其他飼養(yǎng)管理程序與正常生產(chǎn)保持一致。

表1 基礎(chǔ)日糧成分和營養(yǎng)水平

1.2 測定指標與方法

1.2.1 樣品采集 在試驗的第8周末，每個重復隨機選擇1只蛋雞靜脈采血，3 000 r·min-1離心10 min獲得血清，-80 ℃保存。采集輸卵管殼腺部，稱重，取中心部位樣品固定在4%的多聚甲醛中，另取部分樣品置于液氮中速凍。

1.2.2 蛋品質(zhì)檢測 試驗的第8周末，每個重復隨機選取3枚雞蛋(n=6)。使用蛋品質(zhì)分析儀(DET-6000, NABEL, 日本)對蛋重、蛋黃顏色和哈氏單位進行測量，用蛋殼壓力計(Robotmation, 日本)測定蛋殼的強度，用千分尺測量蛋殼的上、中、下三部分的厚度。

1.2.3 血液指標測定 使用南京建成商品試劑盒測定血清中的鈣(C004-2-1)、磷(C006-1-1)含量和堿性磷酸酶(A059-2-2)的活性，試驗步驟嚴格按照說明書進行操作。

1.2.4 殼腺組織學觀察與測定 參照文獻[18]對殼腺樣本進行處理后，使用切片機進行切片(4 μm)， 烘干的切片用二甲苯脫蠟，浸入分級稀釋的乙醇中再水化，并用蘇木精和伊紅(HE)染色。使用顯微鏡(Olympus Optical, 北京)進行觀察和拍照。參照Jiang等[19]的方法測定殼腺絨毛長度、上皮高度和腺體密度。

1.2.5 TUNEL檢測細胞凋亡 采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的去氧尿苷三磷酸鎳末端標記法(TUNEL)檢測殼腺的細胞凋亡。整個試驗使用TUNEL BrightRed凋亡檢測試劑盒(A113, Vazyme Biotech, 南京)，按照說明書進行操作。使用lsm900共焦激光掃描顯微鏡(Carl Zeiss, Oberkochen, 德國)獲得熒光圖片。最后，使用Image-pro Plus 測定凋亡細胞的比率。

1.2.6 殼腺部抗氧化水平檢測 稱取0.2 g殼腺部，用2 mL冰凍PBS勻漿，4 ℃，12 000 g離心10 min，收集上清液，測定抗氧化狀態(tài)。用BCA蛋白測定試劑盒(P0010, Beyotime Biotechnology,上海)測定上清液的蛋白含量。采用抗氧化試劑盒(S0051、S0056、S0121和S0131, Beyotime Biotechnology，上海)檢測殼腺部過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、總抗氧化能力(T-AOC) 和丙二醛(MDA)含量。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測蛋白表達 參照Jiang等[20]的方法，其中，KEAP1、HO-1、NFκB、p-NFκB、 Bcl2、Bax和PCNA為1∶1 000稀釋，Nrf2為1∶1 500稀釋，β-actin、HRP羊抗兔IgG和HRP羊抗鼠IgG均為1∶5 000稀釋。利用FuJI Film(LAS4000)對目的條帶進行拍照，通過Image J 軟件對目的條帶進行灰度分析。

1.2.8 殼腺部相關(guān)基因表達測定 采用Trizol(TaKaRa,大連)法提取殼腺部組織RNA。測定其完整性、濃度和純度后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme, 南京)合成cDNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｊ褂肅hamQTM SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, 南京)，在實時PCR儀 (QuantStudio 7 Flex, Thermo, 美國)中按照說明書進行一步實時RT-PCR。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因GAPDH閾值循環(huán)(CT)，采用2-△△CT法計算樣品中目的基因mRNA的相對表達量。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表2。

表2 引物序列信息

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析(One-way-ANOVA)，結(jié)果以“平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 山楂葉黃酮對殼腺重量及蛋品質(zhì)的影響

為了探究HF對蛋品質(zhì)的影響，本研究對蛋品質(zhì)進行了測定。由表3可見，與CON組相比，日糧中添加HF可以顯著提高蛋殼的強度(P<0.05)和厚度(P<0.05)，蛋殼強度分別提高了18.7%和16.9%，蛋殼厚度分別提高了10%和13.3%。然而，HF處理組與CON組相比，殼腺重(P=0.108)和殼腺相對重(P=0.078)有上升的趨勢，但沒有顯著性差異。

2.2 山楂葉黃酮對血清鈣、磷和堿性磷酸酶的影響

由表4可知，與CON組相比，HHF處理組血清鈣含量顯著升高(P<0.05)；LHF組與CON和HHF組之間沒有顯著性差異(P>0.05)；CON組Ca2+ATP酶活性顯著低于LHF和HHF組(P<0.05)。

表3 日糧山楂葉黃酮對蛋品質(zhì)和器官指數(shù)的影響

表4 日糧山楂葉黃酮對血清鈣、磷含量及堿性磷酸酶活性的影響

2.3 殼腺組織學分析

為了觀察HF對產(chǎn)蛋后期母雞殼腺部形態(tài)學的影響，本研究對母雞的殼腺部組織切片進行了HE染色，同時對殼腺部上皮高度、絨毛長度和腺體密度進行了統(tǒng)計(圖1)。結(jié)果表明，與CON組相比，LHF和HHF組的絨毛長度和腺體密度顯著提高(P<0.05)，上皮高度沒有顯著性差異。

2.4 山楂葉黃酮對殼腺部細胞凋亡的影響

為了評估HF對殼腺部細胞凋亡的影響進行了TUNEL試驗(圖2)。結(jié)果顯示，LHF和HHF處理組凋亡指數(shù)顯著低于CON組(P<0.05)。

2.5 山楂葉黃酮對殼腺抗氧化酶活性的影響

MDA含量、GSH-Px和T-AOC的活性能夠綜合評估殼腺部組織的抗氧化狀態(tài)。結(jié)果顯示，與CON組相比，LHF和HHF處理組MDA含量顯著降低(P<0.05，圖3a)；HHF處理組GSH-Px活性顯著升高(P<0.05，圖3b)。

2.6 山楂葉黃酮對殼腺部蛋白表達的影響

為了測定HF對殼腺部抗氧化和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，本研究通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測了KEAP1、Nfr2、HO-1、NFκB、p-NFκB、Bcl2、Bax和PCNA的相對表達(圖4)。結(jié)果表明，HHF組殼腺部的KEAP1、p-NFκB /NFκB和Bax/Bcl2蛋白相對表達水平顯著低于CON組(P<0.05)；與CON組相比，HHF組Nrf2、HO-1和PCNA蛋白的相對表達量顯著提高(P<0.05)。LHF組Nrf2蛋白的表達水平顯著低于HHF組(P<0.05)，但與CON組無顯著性差異。

2.7 山楂葉黃酮對殼腺部基因mRNA表達的影響

由圖5可知，與CON組相比，HHF和LHF組的CaBP-D28K、OPN和OC-116基因mRNA相對表達水平顯著上調(diào)(P<0.05，圖5a、b、d)；CON和HF處理組之間PMCA1b基因表達量無顯著性差異(圖5c)。

數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤”表示(n=6)，柱上標不同小寫字母(a,b)表示差異顯著(P<0.05)，下圖同Data are presented as “mean value±SEM” (n=6). Without the same mark (a, b) on the column represent statistically significant differences (P < 0.05), the same as in the following figures圖1 日糧山楂葉黃酮對殼腺組織形態(tài)學的影響Fig.1 Effects of dietary HF on the histomorphology of the shell gland

圖2 日糧山楂葉黃酮對殼腺部細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of dietary HF on apoptosis of the shell gland

圖3 日糧山楂葉黃酮對殼腺部組織抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of dietary HF on the oxidative status of shell glands

圖4 日糧山楂葉黃酮對殼腺部蛋白表達的影響Fig.4 Effects of dietary HF supplementation on the protein expression in shell glands

圖5 日糧山楂葉黃酮對殼腺部基因表達的影響Fig.5 Effects of dietary HF supplementation on the gene expression in shell glands

3 討 論

蛋殼的品質(zhì)不僅決定了種雞的孵化性能，還與商品蛋雞的鮮蛋產(chǎn)量、經(jīng)濟效益等密切相關(guān)。在產(chǎn)蛋后期，隨著產(chǎn)蛋日齡的增加蛋殼品質(zhì)通常會下降。如何改善種雞產(chǎn)蛋后期的蛋白品質(zhì)越來越受到人們的關(guān)注。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)可以提高禽類產(chǎn)蛋后期蛋殼的品質(zhì)[21-23]。以往的研究表明，雌激素水平和鈣吸收、代謝能力下降是導致產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)下降的主要原因[24]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HF可以顯著提高產(chǎn)蛋后期種母雞血清中雌激素的水平。這與Shi等[16]研究發(fā)現(xiàn)的灌胃多發(fā)性卵巢綜合征(PCOS)大鼠山楂葉黃酮能夠提高血清雌激素水平結(jié)果一致。此外，Arjmandi等[25]指出，雌激素可以通過雌激素受體途徑促進腸道對鈣的吸收，這可能是HHF處理組血清鈣含量顯著提高的原因之一。因此，本研究認為，山楂葉黃酮通過提高產(chǎn)蛋后期種母雞的雌激素水平，提高血清鈣含量，進而改善蛋殼品質(zhì)。

蛋雞體內(nèi)的鈣代謝異?；钴S，鈣的轉(zhuǎn)運離不開鈣轉(zhuǎn)運體[6]。CaBP-D28K是雞體內(nèi)唯一的鈣結(jié)合蛋白，參與鈣離子的轉(zhuǎn)運[26]；骨橋蛋白(OPN)在殼腺中合成和分泌，是蛋殼基質(zhì)的主要磷酸化蛋白之一，在蛋殼鈣化過程中起到重要作用[27]；蛋殼基質(zhì)蛋白(OC-116)則與蛋殼厚度、彈性模量及蛋形指數(shù)有著密切的關(guān)系[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加HF上調(diào)了CaBP-D28K、OPN和OC-116基因的表達。此外，Ca2+ATP 酶是調(diào)節(jié)鈣離子轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵酶[29]。本研究中，Ca2+ATP 酶的活性增強表明，添加HF可以增加殼腺中鈣離子的轉(zhuǎn)運。因此，山楂葉黃酮可以通過提高鈣離子轉(zhuǎn)運酶的活性，上調(diào)鈣離子轉(zhuǎn)運和基質(zhì)蛋白基因的表達來提高蛋殼品質(zhì)。

氧化應激會阻礙鈣離子在殼腺部的轉(zhuǎn)運，進而降低蛋殼品質(zhì)[8]。MDA和GSH-Px是反映機體抗氧化能力的重要指標，MDA是膜脂過氧化的最終的產(chǎn)物之一；GSH-Px是機體內(nèi)一種重要的過氧化物分解酶。在大鼠肝炎模型中，山楂葉提取物可以降低肝組織勻漿液中MDA含量，提高GSH-Px的活性[30]。與先前的研究結(jié)果一致，日糧中添加HF提高了產(chǎn)蛋后期種母雞殼腺部的抗氧化能力。核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化應激的重要轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下，特異性的受體KEAP1與細胞質(zhì)中Nrf2結(jié)合，抑制其行使功能。但在氧化應激的條件下，KEAP1與Nrf2解離，活化的Nrf2可啟動多種抗氧化酶基因的表達，并在細胞核內(nèi)啟動由抗氧化反應元件(ARE)調(diào)控的HO-1的表達，從而緩解氧化反應引起的細胞損傷。有研究表明，給非酒精性肝炎大鼠灌胃HF可通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路來提高肝的抗氧化能力[17]。在本試驗中，與CON組相比，HHF處理組殼腺組織的KEAP1蛋白表達下調(diào)，HO-1和Nrf2蛋白表達上調(diào)。因此，日糧中添加HF后能夠促進Nrf2的活化和釋放，進一步啟動ARE調(diào)控的Ⅱ期解毒酶和抗氧化酶等下游蛋白的表達。相應地，日糧中添加60 mg·kg-1的HF顯著增強了殼腺中GSH-Px酶的活性?？傊?，日糧中添加HF可以通過激活產(chǎn)蛋后期種母雞殼腺部Nrf2/HO-1信號通路，發(fā)揮其抗氧化作用，來提高產(chǎn)蛋后期種母雞的蛋殼品質(zhì)。

輸卵管殼腺部是蛋殼形成的部位，對蛋殼品質(zhì)起決定性作用[31]。研究表明，殼腺中的腺體在蛋殼形成過程中的主要作用是分泌鈣離子和色素[32]，殼腺腺體的減少將會直接影響鈣離子轉(zhuǎn)運，降低蛋殼品質(zhì)[33]。本研究通過組織學觀察到產(chǎn)蛋后期種母雞出現(xiàn)殼腺絨毛變短和腺體排列混亂、密度降低的現(xiàn)象，日糧中添加HF能明顯改善這些問題。這與前面提及的HF能夠提高殼腺部鈣轉(zhuǎn)運和抗氧化能力的結(jié)果相一致。因此，本研究認為，日糧中添加山楂葉黃酮能夠通過改善殼腺組織形態(tài)來提高蛋殼品質(zhì)。

活性氧引起的氧化應激是機體衰老和功能減退的主要原因[7]。有學者發(fā)現(xiàn)，氧化應激可以導致細胞過度損傷和凋亡[34]，細胞凋亡率可以反映氧化應激的程度[35]，此外，細胞的損傷和凋亡往往伴隨著炎癥反應[36]，本研究發(fā)現(xiàn)，與HF處理組相比，CON組種母雞殼腺部細胞凋亡率和Bax/Bcl2、p-NFκB /NFκB蛋白表達量顯著增加，日糧中添加60 mg·kg-1的HF降低了殼腺細胞的凋亡指數(shù)，下調(diào)了Bax/Bcl2、p-NFκB /NFκB 蛋白的表達。這與HF在治療心臟衰竭方面表現(xiàn)出抗凋亡和抗炎的作用效果相一致[37]。HF的抗凋亡作用也更好地解釋了HHF組殼腺腺體密度和絨毛長度的增加。

4 結(jié) 論

日糧中添加HF通過激活殼腺部Nrf2/HO-1信號通路增強抗氧化能力，增強鈣離子轉(zhuǎn)運能力，改善殼腺部組織形態(tài)，抑制細胞凋亡，從而改善種雞蛋殼品質(zhì)。并且60 mg·kg-1HF的添加水平具有較好效果。