姚麗文,周宇芳,孫繼鵬,王家星,廖妙飛,鄭斌,王芮,鄧尚貴,相興偉,*

1(浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江 舟山,316021) 2(浙江省海洋開發(fā)研究院,浙江 舟山,316021)3(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州,310014)

炎癥性腸病(inflammation bowel disease,IBD)是以腸道炎癥性細(xì)胞浸潤、腸黏膜受損為主要表現(xiàn)的腸道慢性炎癥病變,包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩氏病(crohn′s disease,CD)[1]。目前認(rèn)為IBD是由遺傳、免疫及環(huán)境等多個(gè)因素相互作用所致[2]。IBD的發(fā)病較多緩漸,隱匿病史常為數(shù)月或數(shù)年,亦有持續(xù)活動而不緩解者[3-4],緩解期與活動期又容易反復(fù)交替,需長期維持治療。近年來IBD在我國的發(fā)病率逐年上升,帶來重大醫(yī)療負(fù)擔(dān)[5],而有關(guān)治療IBD的新藥多從調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)方面入手[6]。多糖作為保健食品和藥物的良好來源之一,受到人們的普遍關(guān)注。魏江洲等[7]發(fā)現(xiàn)海螵蛸多糖緩解炎癥的路徑是加速潰瘍組織的愈合,同時(shí)降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達(dá)。日本研究人員在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),海帶中的昆布多糖能防止?jié)冃越Y(jié)腸炎等炎性腸病[8]。

厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)是一種近海暖溫性底棲雙殼軟體動物[9],富含蛋白質(zhì)、活性多糖和氨基酸等多種營養(yǎng)成分,被譽(yù)為“海中雞蛋”[10]。其中多糖是由10個(gè)以上的單糖以糖苷鍵連接而成的一類天然高分子多聚物[11],在貽貝中的含量豐富。研究表明貽貝多糖具有調(diào)節(jié)免疫[12]、抗腫瘤[13]、抗衰老[14]、抗氧化[15]、預(yù)防非酒精性脂肪肝[16]和降血脂血糖[17]等功能活性。姚瀅[18]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝多糖(Mytiluscoruscuspolysaccharide,MP)不僅能增加小鼠脾淋巴細(xì)胞活性,而且能增強(qiáng)機(jī)體免疫和抗氧化作用。欒潔等[19]研究發(fā)現(xiàn)MP可增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)及吞噬作用,調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能，因此把MP作為預(yù)防和治療炎性疾病的活性成分研究具有重要的意義。

MP具有抗氧化及免疫調(diào)節(jié)的作用,而結(jié)腸炎很大程度上是與氧化過激或免疫失調(diào)等相關(guān),但貽貝多糖對結(jié)腸炎的改善作用尚未見報(bào)道[20-22]。因此,通過建立由葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型,研究MP對模型小鼠體重、結(jié)腸組織病變以及血清和結(jié)腸組織中谷胱甘肽還原酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、TNF-α和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平的影響,探討厚殼貽貝多糖對結(jié)腸炎能否起到改善作用,以便為貽貝多糖預(yù)防和改善結(jié)腸炎提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料

厚殼貽貝購買自浙江舟山東河市場。去除外殼后,將貝肉洗凈剪碎后加入適量純水勻漿,在勻漿液中分別加入20 g木瓜蛋白酶和胰蛋白酶,在50 ℃,pH 7的條件下酶解6 h,酶解完成后于95 ℃水浴中進(jìn)行酶滅活,在10 000 r/min條件下離心10 min后取上清液,上清液經(jīng)乙醇梯度醇沉[23],取沉淀,真空冷凍干燥后得到貽貝粗多糖。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級ICR小鼠,雄性,4周齡,體重(20±1) g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)糧,自由采食飲水,溫度(24±1)℃,濕度(65±5)%,光暗周期12/12 h,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究遵循的程序符合負(fù)責(zé)本單位動物試驗(yàn)委員會所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),批準(zhǔn)文號為2019003。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DSS(分子質(zhì)量36 k～50 kDa),美國加州MP Biomedicals 公司；小鼠標(biāo)準(zhǔn)糧,蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動物飼料科技有限公司。Mouse TNF alpha ELISA Kit、Mouse IL-6 ELISA Kit,博士德生物工程有限公司；GSH-PX、SOD試劑盒,南京建成生物工程研究所；乙醇等試驗(yàn)試劑(分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

902型超低溫冰箱,青島海爾股份有限公司；IKA T10勻漿機(jī),新芝生物科技有限公司；Micro21R高速冷凍離心機(jī),賽默飛世爾科技有限公司；Synergy H1全功能微孔板檢測儀,美國BioTek；BP211D電子天平,美國Sartorius。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠模型的制備

口服DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸模型與人類發(fā)病機(jī)制極為相似,許多研究均采用這一模型[24-25],本次實(shí)驗(yàn)也采用這一模型來探討厚殼貽貝多糖改善由DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的機(jī)制。

將適應(yīng)1周的小鼠,按平均體重?zé)o顯著性差異分為3組,每組6只。空白組和模型組(DSS組)每日灌胃生理鹽水,貽貝多糖組灌胃MP[300 mg MP/(kg BW·d)],每日1次,2周后DSS組和MP組日常飲用水中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5%的DSS,連續(xù)7 d,每隔2 d更換一次新配的DSS溶液[26]。

1.4.2 測量指標(biāo)和方法

1.4.2.1 疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)

從DSS誘發(fā)結(jié)腸炎模型第1天起,每天記錄小鼠體重,觀察糞便性狀及肉眼血便情況[27],根據(jù)小鼠的情況記錄打分。DAI按公式(1)計(jì)算[28]：

(1)

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Disease activity index scoring system

1.4.2.2 ELISA 法檢測結(jié)腸和血漿內(nèi)炎癥因子的含量及抗氧化指標(biāo)

在實(shí)驗(yàn)的第21天,采集小鼠眼球處血液,4 ℃冰箱保存一夜,低溫4 000 r/min離心15 min后取上清液,根據(jù)不同試劑盒的說明書檢測血清中的GSH-Px、SOD、TNF-α和IL-6。解剖后,取出腸道,剔除腸系膜,拍照并記錄結(jié)腸長度,分別取不同處理組的結(jié)腸100 mg,加入1 mL無菌生理鹽水,使用電動勻漿機(jī)將腸道磨至黏液狀,低溫4 000 r/min離心10 min,取上清液分裝,保存在-80 ℃的冰箱中。用BCA試劑盒測定蛋白濃度,根據(jù)不同試劑盒的說明書檢測腸道的GSH-Px、SOD、TNF-α、和IL-6。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用Graph Pad Prism10.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05表示有顯著性差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MP對結(jié)腸炎小鼠體態(tài)特征的影響

在給予除空白組以外的小鼠DSS造模的7 d內(nèi),與空白組相比,DSS組小鼠毛發(fā)微微發(fā)黃、雜亂,行動遲緩,個(gè)別小鼠拉稀,肛門處可以明顯觀察到血便的痕跡。MP組的小鼠少見血便,拉稀癥狀有所減輕。結(jié)腸長度縮短在一定程度上可以作為一項(xiàng)指標(biāo)來衡量炎癥的嚴(yán)重程度[29]。解剖后發(fā)現(xiàn),小鼠的結(jié)腸明顯皺縮,結(jié)腸內(nèi)容物發(fā)黑,以上現(xiàn)象可以表明,結(jié)腸炎模型造模成功。

通過圖1-a可以看出,在日常飲用水中加入DSS后,DSS組小鼠隨著時(shí)間變化呈現(xiàn)下降水平,而MP組小鼠雖然也呈現(xiàn)下降趨勢,但體重下降比DSS組平緩很多,情況相對良好。圖1-b反映了小鼠體重變化、糞便松散程度以及糞便出血情況,可以看到MP組的DAI低于DSS組,證明經(jīng)過給藥處理后,小鼠的生理狀況得到了一定的改善。從圖1-c和圖1-d中發(fā)現(xiàn)飲用DSS后小鼠結(jié)腸長度都有一定程度變短,但MP+DSS組結(jié)腸縮短的情況好于DSS單獨(dú)造模組,MP+DSS組結(jié)腸長度與肉眼觀察情況也均顯著好于DSS組(P<0.05)。表明MP可以改善由DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠引起的結(jié)腸縮短。

a-體重變化;b-DAI;c-結(jié)腸形態(tài);d-結(jié)腸長度圖1 MP對結(jié)腸炎小鼠體重變化、DAI、結(jié)腸形態(tài)、結(jié)腸長度的影響Fig.1 Effect of MP on body weight change, disease activity index, macroscopic appearances of colons and colon length of colitis in mice注:*表示具有顯著性差異(* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001)(下同)

2.2 對結(jié)腸炎小鼠腸道組織形態(tài)的影響

通過蘇木精-伊紅(hematoxyin-eosin,HE)染色對腸道組織進(jìn)行評價(jià),結(jié)果如圖2所示?？瞻捉M小鼠的結(jié)腸組織表面上皮完整,隱窩無破壞,且無明顯的炎性細(xì)胞,腺體排列緊密規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰(2-a)；模型組出現(xiàn)明顯的腸壁增厚,固有層內(nèi)存在大面積中性粒細(xì)胞浸潤,絨毛上皮細(xì)胞大面積壞死,腸腔可見壞死上皮細(xì)胞以及壞死組織和炎性細(xì)胞浸潤,黏膜上皮出現(xiàn)較大潰瘍,炎癥程度明顯高于正常組(圖2-b)。

a-空白組；b-模型組；c-MP：DSS+300 mg/kg MP(下同)圖2 腸道組織切片HE染色Fig.2 HE staining of intestinal tissue sections

而在MP組中,出現(xiàn)可見的隱窩結(jié)構(gòu),腸壁水腫轉(zhuǎn)為輕度,腸絨毛上皮完整,中性粒細(xì)胞浸潤明顯緩解,炎性程度減輕(圖2-c),說明MP對腸道發(fā)揮保護(hù)作用。

2.3 MP對結(jié)腸炎小鼠腸道指標(biāo)的影響

2.3.1 MP對結(jié)腸炎小鼠腸道抗氧化水平的影響

SOD與GSH均是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中的重要成員,可有效分解過氧化物、脂質(zhì)過氧化物,中止脂質(zhì)過氧化反應(yīng),SOD、GSH水平可反映機(jī)體清除氧自由基的能力[30]。GSH-Px 可特異催化GSH對H2O2的還原反應(yīng)使之變成水,有效維持細(xì)胞穩(wěn)定性,保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)[31]。從圖3中可以看出與空白組相比,DSS組的GSH-Px和SOD的水平顯著下降(P<0.05),與DSS組相比,MP組的GSH-Px和SOD水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明MP在一定程度上改善了DSS誘導(dǎo)的腸道應(yīng)激。

a-GSH-Px;b-SOD圖3 MP對小鼠結(jié)腸抗氧化水平GSH-Px和SOD的影響Fig.3 Effect of MP on antioxidant levels of GSH-Px and SOD in colonic tissue

2.3.2 MP對結(jié)腸炎小鼠腸道炎性因子水平的影響

細(xì)胞因子在IBD中起重要作用,包括致炎和抗炎作用。TNF-α和IL-6的含量在很大程度上可以反映炎癥的輕重程度[32]。由圖4可知，與空白組相比,DSS組小鼠結(jié)腸的促炎細(xì)胞因子TNF-α水平顯著上升(P<0.05),而IL-6無顯著性變化,可能是因?yàn)镈SS組的取樣小鼠的炎癥不是特別嚴(yán)重；與DSS組相比,MP組小鼠的結(jié)腸TNF-α和IL-6呈下降趨勢；與空白組相比,MP組的TNF-α和IL-6水平無顯著性差異(P>0.05)?？傮w上來說,MP有利于改善小鼠的炎癥反應(yīng)。

圖4 MP對小鼠結(jié)腸炎癥細(xì)胞因子水平TNF-α和IL-6的影響Fig.4 Effects on the levels of TNF-α and IL-6 in the serum of mice

2.4 MP對結(jié)腸炎小鼠血清指標(biāo)的影響

2.4.1 MP對結(jié)腸炎小鼠血清抗氧化水平的影響

由圖5可知，與空白組相比,DSS組GSH-Px水平顯著降低(P<0.01),SOD水平雖然下降但未呈現(xiàn)出顯著性差異,而MP組與DSS組相比,血清中的GSH-Px顯著升高(P<0.01),SOD則未呈現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。與空白組相比,MP組的GSH-Px和SOD水平?jīng)]有呈現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)。從血清水平可以證明,MP在一定程度上能提高小鼠的抗氧化能力。

a-GSH-Px;b-SOD圖5 MP對小鼠血清中抗氧化水平GSH-Px和SOD的影響Fig.5 Effect of MP on antioxidant levels of GSH-Px and SOD in mice

2.4.2 MP對結(jié)腸炎小鼠血清炎性因子水平的影響

由圖6可知，與空白組相比,DSS組小鼠結(jié)腸中TNF-α水平顯著升高(P<0.05),MP組小鼠TNF-α顯著性下降(P<0.01),但3組的IL-6水平無顯著性差異,可能是因?yàn)榭瞻捉M的小鼠體重較高,而MP組的小鼠給藥后預(yù)后不良。從血清水平可以證明,MP在一定程度改善了小鼠的炎癥反應(yīng)。

a-TNF-α;b-IL-6圖6 MP對小鼠血清中細(xì)胞因子水平TNF-α和IL-6的影響Fig.6 Effects on the levels of TNF-α and IL-6 in the serum of mice

3 結(jié)論與討論

從本次實(shí)驗(yàn)來看,MP對大鼠的日常活動、飲水進(jìn)食、排便等各方面都有改善作用,與其余各組相比,模型組DAI評分明顯增高(P<0.05)。分析給予DSS后一周內(nèi)體重變化結(jié)果,與空白組相比,模型組體重顯著性下降(P<0.05)；藥物組體重下降,但下降趨勢未超過模型組,2組存在顯著性差異(P<0.05)。通過各組實(shí)驗(yàn)大鼠的結(jié)腸組織HE病理切片結(jié)果,空白組結(jié)腸部分腸壁清晰,無炎性浸潤,情況正常；模型組結(jié)腸部分出現(xiàn)十分明顯的炎性浸潤,腸黏膜破壞嚴(yán)重,炎癥活動程度最重；MP組與DSS組相比,腸壁明顯更完整,炎性浸潤程度減輕,排列也更加清晰,說明MP可以減輕小鼠的炎癥反應(yīng)。

在炎性腸病中通常炎性因子TNF-α[33]、IL-6等表達(dá)會一起升高[34],表明調(diào)控這些炎癥因子非常重要。通過在血清水平和結(jié)腸組織勻漿液水平測定TNF-ɑ和IL-6的表達(dá)水平,可以明顯看到MP能夠顯著降低TNF-α和IL-6表達(dá),這表明MP可以通過調(diào)節(jié)多種信號通路抑制促炎癥細(xì)胞因子表達(dá),對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎產(chǎn)生免疫治療作用,保護(hù)受損結(jié)腸組織。通過在血清水平和結(jié)腸組織勻漿液測定GSH-Px和SOD的表達(dá)水平,可以看到MP能一定程度的提高GSH-Px和SOD表達(dá),這能證明MP能增強(qiáng)機(jī)體抵抗氧化過激引起的損傷,提升總抗氧化能力,減輕IBD中結(jié)腸的損傷程度[35],有效改善機(jī)體的炎癥受損狀況,從而提高免疫力,減緩機(jī)體的結(jié)腸炎癥狀,對治療炎癥性疾病起到一定的治療效果。

目前,炎癥性疾病臨床治療藥物主要包括糖皮質(zhì)激素類和免疫抑制劑[36],兩類治療藥物雖能在短時(shí)間內(nèi)改善癥狀,但使用頻率過高或周期長將會導(dǎo)致副作用產(chǎn)生,長期服用后藥效不佳[21]。因此積極防治潰瘍性結(jié)腸炎顯得十分重要與迫切,尋求有效且無副作用或副作用低的治療藥物是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。MP具有抗炎作用,這將為防治結(jié)腸炎提供新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)MP能抑制小鼠結(jié)腸炎的炎癥因子表達(dá)和降低炎癥因子在血清的濃度,顯著減少炎癥細(xì)胞的浸潤和結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的損傷,對小鼠結(jié)腸炎癥能起到一定的改善作用。本研究可為預(yù)防腸炎的功能性食品或保健品開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。