姚麗文,周宇芳,孫繼鵬,王家星,廖妙飛,鄭斌,王芮,鄧尚貴,相興偉,*

1(浙江海洋大學 食品與醫(yī)藥學院,浙江 舟山,316021) 2(浙江省海洋開發(fā)研究院,浙江 舟山,316021)3(浙江工業(yè)大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310014)

炎癥性腸病(inflammation bowel disease,IBD)是以腸道炎癥性細胞浸潤、腸黏膜受損為主要表現(xiàn)的腸道慢性炎癥病變,包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩氏病(crohn′s disease,CD)[1]。目前認為IBD是由遺傳、免疫及環(huán)境等多個因素相互作用所致[2]。IBD的發(fā)病較多緩漸,隱匿病史常為數(shù)月或數(shù)年,亦有持續(xù)活動而不緩解者[3-4],緩解期與活動期又容易反復交替,需長期維持治療。近年來IBD在我國的發(fā)病率逐年上升,帶來重大醫(yī)療負擔[5],而有關治療IBD的新藥多從調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應方面入手[6]。多糖作為保健食品和藥物的良好來源之一,受到人們的普遍關注。魏江洲等[7]發(fā)現(xiàn)海螵蛸多糖緩解炎癥的路徑是加速潰瘍組織的愈合,同時降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達。日本研究人員在動物實驗中發(fā)現(xiàn),海帶中的昆布多糖能防止?jié)冃越Y(jié)腸炎等炎性腸病[8]。

厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)是一種近海暖溫性底棲雙殼軟體動物[9],富含蛋白質(zhì)、活性多糖和氨基酸等多種營養(yǎng)成分,被譽為“海中雞蛋”[10]。其中多糖是由10個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的一類天然高分子多聚物[11],在貽貝中的含量豐富。研究表明貽貝多糖具有調(diào)節(jié)免疫[12]、抗腫瘤[13]、抗衰老[14]、抗氧化[15]、預防非酒精性脂肪肝[16]和降血脂血糖[17]等功能活性。姚瀅[18]通過實驗發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝多糖(Mytiluscoruscuspolysaccharide,MP)不僅能增加小鼠脾淋巴細胞活性,而且能增強機體免疫和抗氧化作用。欒潔等[19]研究發(fā)現(xiàn)MP可增強小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應及吞噬作用,調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能，因此把MP作為預防和治療炎性疾病的活性成分研究具有重要的意義。

MP具有抗氧化及免疫調(diào)節(jié)的作用,而結(jié)腸炎很大程度上是與氧化過激或免疫失調(diào)等相關,但貽貝多糖對結(jié)腸炎的改善作用尚未見報道[20-22]。因此,通過建立由葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導的結(jié)腸炎小鼠模型,研究MP對模型小鼠體重、結(jié)腸組織病變以及血清和結(jié)腸組織中谷胱甘肽還原酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、TNF-α和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平的影響,探討厚殼貽貝多糖對結(jié)腸炎能否起到改善作用,以便為貽貝多糖預防和改善結(jié)腸炎提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

厚殼貽貝購買自浙江舟山東河市場。去除外殼后,將貝肉洗凈剪碎后加入適量純水勻漿,在勻漿液中分別加入20 g木瓜蛋白酶和胰蛋白酶,在50 ℃,pH 7的條件下酶解6 h,酶解完成后于95 ℃水浴中進行酶滅活,在10 000 r/min條件下離心10 min后取上清液,上清液經(jīng)乙醇梯度醇沉[23],取沉淀,真空冷凍干燥后得到貽貝粗多糖。

1.1.2 實驗動物

SPF級ICR小鼠,雄性,4周齡,體重(20±1) g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠給予標準糧,自由采食飲水,溫度(24±1)℃,濕度(65±5)%,光暗周期12/12 h,適應性飼養(yǎng)1周。本研究遵循的程序符合負責本單位動物試驗委員會所制訂的倫理學標準,批準文號為2019003。

1.2 實驗試劑

DSS(分子質(zhì)量36 k～50 kDa),美國加州MP Biomedicals 公司；小鼠標準糧,蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司。Mouse TNF alpha ELISA Kit、Mouse IL-6 ELISA Kit,博士德生物工程有限公司；GSH-PX、SOD試劑盒,南京建成生物工程研究所；乙醇等試驗試劑(分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 實驗儀器

902型超低溫冰箱,青島海爾股份有限公司；IKA T10勻漿機,新芝生物科技有限公司；Micro21R高速冷凍離心機,賽默飛世爾科技有限公司；Synergy H1全功能微孔板檢測儀,美國BioTek；BP211D電子天平,美國Sartorius。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠模型的制備

口服DSS誘導的結(jié)腸模型與人類發(fā)病機制極為相似,許多研究均采用這一模型[24-25],本次實驗也采用這一模型來探討厚殼貽貝多糖改善由DSS誘導的結(jié)腸炎的機制。

將適應1周的小鼠,按平均體重無顯著性差異分為3組,每組6只。空白組和模型組(DSS組)每日灌胃生理鹽水,貽貝多糖組灌胃MP[300 mg MP/(kg BW·d)],每日1次,2周后DSS組和MP組日常飲用水中加入質(zhì)量分數(shù)3.5%的DSS,連續(xù)7 d,每隔2 d更換一次新配的DSS溶液[26]。

1.4.2 測量指標和方法

1.4.2.1 疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)

從DSS誘發(fā)結(jié)腸炎模型第1天起,每天記錄小鼠體重,觀察糞便性狀及肉眼血便情況[27],根據(jù)小鼠的情況記錄打分。DAI按公式(1)計算[28]：

(1)

表1 DAI評分標準Table 1 Disease activity index scoring system

1.4.2.2 ELISA 法檢測結(jié)腸和血漿內(nèi)炎癥因子的含量及抗氧化指標

在實驗的第21天,采集小鼠眼球處血液,4 ℃冰箱保存一夜,低溫4 000 r/min離心15 min后取上清液,根據(jù)不同試劑盒的說明書檢測血清中的GSH-Px、SOD、TNF-α和IL-6。解剖后,取出腸道,剔除腸系膜,拍照并記錄結(jié)腸長度,分別取不同處理組的結(jié)腸100 mg,加入1 mL無菌生理鹽水,使用電動勻漿機將腸道磨至黏液狀,低溫4 000 r/min離心10 min,取上清液分裝,保存在-80 ℃的冰箱中。用BCA試劑盒測定蛋白濃度,根據(jù)不同試劑盒的說明書檢測腸道的GSH-Px、SOD、TNF-α、和IL-6。

1.5 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)應用Graph Pad Prism10.01軟件進行統(tǒng)計學分析,P<0.05表示有顯著性差異,具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MP對結(jié)腸炎小鼠體態(tài)特征的影響

在給予除空白組以外的小鼠DSS造模的7 d內(nèi),與空白組相比,DSS組小鼠毛發(fā)微微發(fā)黃、雜亂,行動遲緩,個別小鼠拉稀,肛門處可以明顯觀察到血便的痕跡。MP組的小鼠少見血便,拉稀癥狀有所減輕。結(jié)腸長度縮短在一定程度上可以作為一項指標來衡量炎癥的嚴重程度[29]。解剖后發(fā)現(xiàn),小鼠的結(jié)腸明顯皺縮,結(jié)腸內(nèi)容物發(fā)黑,以上現(xiàn)象可以表明,結(jié)腸炎模型造模成功。

通過圖1-a可以看出,在日常飲用水中加入DSS后,DSS組小鼠隨著時間變化呈現(xiàn)下降水平,而MP組小鼠雖然也呈現(xiàn)下降趨勢,但體重下降比DSS組平緩很多,情況相對良好。圖1-b反映了小鼠體重變化、糞便松散程度以及糞便出血情況,可以看到MP組的DAI低于DSS組,證明經(jīng)過給藥處理后,小鼠的生理狀況得到了一定的改善。從圖1-c和圖1-d中發(fā)現(xiàn)飲用DSS后小鼠結(jié)腸長度都有一定程度變短,但MP+DSS組結(jié)腸縮短的情況好于DSS單獨造模組,MP+DSS組結(jié)腸長度與肉眼觀察情況也均顯著好于DSS組(P<0.05)。表明MP可以改善由DSS誘導的結(jié)腸炎小鼠引起的結(jié)腸縮短。

a-體重變化;b-DAI;c-結(jié)腸形態(tài);d-結(jié)腸長度圖1 MP對結(jié)腸炎小鼠體重變化、DAI、結(jié)腸形態(tài)、結(jié)腸長度的影響Fig.1 Effect of MP on body weight change, disease activity index, macroscopic appearances of colons and colon length of colitis in mice注:*表示具有顯著性差異(* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001)(下同)

2.2 對結(jié)腸炎小鼠腸道組織形態(tài)的影響

通過蘇木精-伊紅(hematoxyin-eosin,HE)染色對腸道組織進行評價,結(jié)果如圖2所示?？瞻捉M小鼠的結(jié)腸組織表面上皮完整,隱窩無破壞,且無明顯的炎性細胞,腺體排列緊密規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰(2-a)；模型組出現(xiàn)明顯的腸壁增厚,固有層內(nèi)存在大面積中性粒細胞浸潤,絨毛上皮細胞大面積壞死,腸腔可見壞死上皮細胞以及壞死組織和炎性細胞浸潤,黏膜上皮出現(xiàn)較大潰瘍,炎癥程度明顯高于正常組(圖2-b)。

a-空白組；b-模型組；c-MP：DSS+300 mg/kg MP(下同)圖2 腸道組織切片HE染色Fig.2 HE staining of intestinal tissue sections

而在MP組中,出現(xiàn)可見的隱窩結(jié)構(gòu),腸壁水腫轉(zhuǎn)為輕度,腸絨毛上皮完整,中性粒細胞浸潤明顯緩解,炎性程度減輕(圖2-c),說明MP對腸道發(fā)揮保護作用。

2.3 MP對結(jié)腸炎小鼠腸道指標的影響

2.3.1 MP對結(jié)腸炎小鼠腸道抗氧化水平的影響

SOD與GSH均是機體抗氧化系統(tǒng)中的重要成員,可有效分解過氧化物、脂質(zhì)過氧化物,中止脂質(zhì)過氧化反應,SOD、GSH水平可反映機體清除氧自由基的能力[30]。GSH-Px 可特異催化GSH對H2O2的還原反應使之變成水,有效維持細胞穩(wěn)定性,保護細胞結(jié)構(gòu)[31]。從圖3中可以看出與空白組相比,DSS組的GSH-Px和SOD的水平顯著下降(P<0.05),與DSS組相比,MP組的GSH-Px和SOD水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明MP在一定程度上改善了DSS誘導的腸道應激。

a-GSH-Px;b-SOD圖3 MP對小鼠結(jié)腸抗氧化水平GSH-Px和SOD的影響Fig.3 Effect of MP on antioxidant levels of GSH-Px and SOD in colonic tissue

2.3.2 MP對結(jié)腸炎小鼠腸道炎性因子水平的影響

細胞因子在IBD中起重要作用,包括致炎和抗炎作用。TNF-α和IL-6的含量在很大程度上可以反映炎癥的輕重程度[32]。由圖4可知，與空白組相比,DSS組小鼠結(jié)腸的促炎細胞因子TNF-α水平顯著上升(P<0.05),而IL-6無顯著性變化,可能是因為DSS組的取樣小鼠的炎癥不是特別嚴重；與DSS組相比,MP組小鼠的結(jié)腸TNF-α和IL-6呈下降趨勢；與空白組相比,MP組的TNF-α和IL-6水平無顯著性差異(P>0.05)?？傮w上來說,MP有利于改善小鼠的炎癥反應。

圖4 MP對小鼠結(jié)腸炎癥細胞因子水平TNF-α和IL-6的影響Fig.4 Effects on the levels of TNF-α and IL-6 in the serum of mice

2.4 MP對結(jié)腸炎小鼠血清指標的影響

2.4.1 MP對結(jié)腸炎小鼠血清抗氧化水平的影響

由圖5可知，與空白組相比,DSS組GSH-Px水平顯著降低(P<0.01),SOD水平雖然下降但未呈現(xiàn)出顯著性差異,而MP組與DSS組相比,血清中的GSH-Px顯著升高(P<0.01),SOD則未呈現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。與空白組相比,MP組的GSH-Px和SOD水平?jīng)]有呈現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)。從血清水平可以證明,MP在一定程度上能提高小鼠的抗氧化能力。

a-GSH-Px;b-SOD圖5 MP對小鼠血清中抗氧化水平GSH-Px和SOD的影響Fig.5 Effect of MP on antioxidant levels of GSH-Px and SOD in mice

2.4.2 MP對結(jié)腸炎小鼠血清炎性因子水平的影響

由圖6可知，與空白組相比,DSS組小鼠結(jié)腸中TNF-α水平顯著升高(P<0.05),MP組小鼠TNF-α顯著性下降(P<0.01),但3組的IL-6水平無顯著性差異,可能是因為空白組的小鼠體重較高,而MP組的小鼠給藥后預后不良。從血清水平可以證明,MP在一定程度改善了小鼠的炎癥反應。

a-TNF-α;b-IL-6圖6 MP對小鼠血清中細胞因子水平TNF-α和IL-6的影響Fig.6 Effects on the levels of TNF-α and IL-6 in the serum of mice

3 結(jié)論與討論

從本次實驗來看,MP對大鼠的日常活動、飲水進食、排便等各方面都有改善作用,與其余各組相比,模型組DAI評分明顯增高(P<0.05)。分析給予DSS后一周內(nèi)體重變化結(jié)果,與空白組相比,模型組體重顯著性下降(P<0.05)；藥物組體重下降,但下降趨勢未超過模型組,2組存在顯著性差異(P<0.05)。通過各組實驗大鼠的結(jié)腸組織HE病理切片結(jié)果,空白組結(jié)腸部分腸壁清晰,無炎性浸潤,情況正常；模型組結(jié)腸部分出現(xiàn)十分明顯的炎性浸潤,腸黏膜破壞嚴重,炎癥活動程度最重；MP組與DSS組相比,腸壁明顯更完整,炎性浸潤程度減輕,排列也更加清晰,說明MP可以減輕小鼠的炎癥反應。

在炎性腸病中通常炎性因子TNF-α[33]、IL-6等表達會一起升高[34],表明調(diào)控這些炎癥因子非常重要。通過在血清水平和結(jié)腸組織勻漿液水平測定TNF-ɑ和IL-6的表達水平,可以明顯看到MP能夠顯著降低TNF-α和IL-6表達,這表明MP可以通過調(diào)節(jié)多種信號通路抑制促炎癥細胞因子表達,對實驗性結(jié)腸炎產(chǎn)生免疫治療作用,保護受損結(jié)腸組織。通過在血清水平和結(jié)腸組織勻漿液測定GSH-Px和SOD的表達水平,可以看到MP能一定程度的提高GSH-Px和SOD表達,這能證明MP能增強機體抵抗氧化過激引起的損傷,提升總抗氧化能力,減輕IBD中結(jié)腸的損傷程度[35],有效改善機體的炎癥受損狀況,從而提高免疫力,減緩機體的結(jié)腸炎癥狀,對治療炎癥性疾病起到一定的治療效果。

目前,炎癥性疾病臨床治療藥物主要包括糖皮質(zhì)激素類和免疫抑制劑[36],兩類治療藥物雖能在短時間內(nèi)改善癥狀,但使用頻率過高或周期長將會導致副作用產(chǎn)生,長期服用后藥效不佳[21]。因此積極防治潰瘍性結(jié)腸炎顯得十分重要與迫切,尋求有效且無副作用或副作用低的治療藥物是一項艱巨的任務。MP具有抗炎作用,這將為防治結(jié)腸炎提供新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)MP能抑制小鼠結(jié)腸炎的炎癥因子表達和降低炎癥因子在血清的濃度,顯著減少炎癥細胞的浸潤和結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的損傷,對小鼠結(jié)腸炎癥能起到一定的改善作用。本研究可為預防腸炎的功能性食品或保健品開發(fā)提供理論和實驗基礎。