吳小艷,劉文星,劉忠義*,李希宇,付滿,李汀

1(北部灣大學 食品工程學院,廣西 欽州,535011) 2(湘潭大學 化工學院,湖南 湘潭,411105)

酸奶中含有大量活性乳酸菌,在酸奶的貯運和分銷過程中仍會進行新陳代謝,緩慢產酸并產生風味物質,因而需要保證所有環(huán)節(jié)處于低溫環(huán)境,以抑制有害微生物的生長繁殖和延緩產酸的速度[1-2],從而保證酸奶的感官和安全品質,延長其保質期。但很多時候因成本高昂難以實現(xiàn)全程冷鏈,而采用熱處理殺菌方法將對酸奶風味產生不良影響,乳酸菌素的出現(xiàn)給上述問題指出了解決方向與途徑[1-2]。

乳酸菌素是由乳酸菌發(fā)酵產生的一類抗菌素[3]。國內關于乳酸菌素的相關研究起步于1980年代,主要是以乳酸鏈球菌素的研究為主[4-5]。由于乳酸菌素具有安全性高等優(yōu)點,在抑菌、防腐、保鮮等方面成為研究熱點,被公認為安全的純天然微生物防腐劑和抗菌劑[5],廣泛應用于各類食品的防腐保鮮貯藏[6-7]和醫(yī)藥領域[8]。除了單獨使用,乳酸菌素還可與納他霉素等其他食品防腐劑聯(lián)合使用[9-10]。作為乳酸菌的次生代謝產物,乳酸菌素的產生受到菌株生長、pH、溫度等多種因素的影響[11-14]。然而,在酸奶正常發(fā)酵條件下,作為發(fā)酵劑的乳酸菌是否會在酸奶生產及其貯運過程中產生乳酸菌素仍未可知。

本研究以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對象菌,通過逐步排除實驗,對芒果酸奶中可能的抑菌物質進行了研究,確認了芒果酸奶發(fā)酵、后熟及貯藏過程中所有的抑菌物質,為芒果酸奶的抑菌和品質保證提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸奶發(fā)酵劑(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌),北京川秀國際貿易有限公司；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),賽莫爾科學實驗用品有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、過氧化氫酶,食品級,河南萬邦實業(yè)有限公司；其他均為生化試劑或者分析純。

1.2 儀器與設備

YB游標卡尺,安冠龍儀器有限公司；SCIENTZ-18 N牛津杯,寧波新芝生物科技股份有限公司；SPX-250B-D振蕩培養(yǎng)箱,上海博遠實業(yè)有限公司；BAS224S電子天平,賽多利斯科技有限公司；DL-6M冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

酸奶的制作：將水和奶粉按質量比1∶8混合溶解,8%(復原乳質量分數(shù),下同)的白砂糖和適量穩(wěn)定劑混合后加熱溶解,待穩(wěn)定劑完全溶解后再加入復原乳中,在60 MPa下均質10 min后倒入圓底燒瓶中,95 ℃滅菌5 min[15],倒入燒杯冷卻至45 ℃左右,加入5%的芒果醬,添加1%酸奶發(fā)酵劑攪拌均勻后密封,43 ℃下發(fā)酵10 h后取出,待冷卻至室溫后,在1 000 r/min下攪拌5 min,密封后置于4 ℃冰箱中后熟24 h,發(fā)酵完成[16]。然后繼續(xù)置于4 ℃冰箱中后熟72 h。不添加芒果醬及穩(wěn)定劑的酸奶做為空白對照。

酸奶發(fā)酵液的準備：將后熟0、12、24、36、48、60和72 h的芒果酸奶,在超凈工作臺中分別取30 mL置于50 mL離心管中,并于冷凍離心機中在4 ℃,6 000 r/min下離心30 min,收集上清液,置于4 ℃冰箱中冷藏備用[17]。

1.3.2 指示菌的培養(yǎng)

將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別從菌種斜面上接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。用無菌生理鹽水將斜面細胞洗下制成菌懸液,利用血球計數(shù)板計數(shù),將菌懸液稀釋至濃度106CFU/mL[18-19],備用。在300 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(60 ℃左右)中添加3 mL稀釋的指示菌菌懸液搖勻,制成指示菌培養(yǎng)基。

1.3.3 酸奶抑菌作用的測定

先在滅菌平皿中注入冷卻至50～60 ℃左右的2.0%的素瓊脂,待凝固后,用無菌鑷子取4個直徑為8 mm的無菌牛津杯置于其中,再倒入含有指示菌的培養(yǎng)基,凝固后用鑷子拔去牛津杯。在牛津杯孔中加入200 μL前述酸奶發(fā)酵上清液,做好標記并迅速放入4 ℃冰箱中擴散4 h,再放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察是否有抑菌圈,并測量其直徑的大小。

1.3.4 酸抑菌作用排除實驗

酸奶發(fā)酵過程產生乳酸等酸性物質會對一些細菌有抑菌作用,為排除酸及其他酸性末端產物的干擾[20],用1 mol/L NaOH溶液調整無細胞發(fā)酵液的pH值為6.0(對指示菌無抑制作用)[17]，按1.3.3小節(jié)的方法完成實驗。

1.3.5 H2O2抑菌作用排除實驗

乳酸菌代謝過程會產生H2O2等強氧化性物質,對一些細菌也有抑制作用[21]。為進一步排除干擾,取6.0 mL酸奶上清液,調節(jié)pH至7.0,加入60 mg過氧化氫酶,輕輕搖晃至溶解,37 ℃保溫2 h,再將pH調至6.0,用雙層牛津杯法進行抑菌實驗。

1.3.6 蛋白酶驗證實驗

取3份6.0 mL酸奶上清液,調節(jié)pH值為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶作用的最適pH值(7.4、6.0 和2.0),分別于3份酸奶上清液中加入6.0 mg不同酶液,在適宜溫度下(分別為37、55和37 ℃)反應4 h后調回原始pH值,測定酶處理后與處理前的抑菌活性[22],以確定酸奶排除過氧化物作用后,剩余的抑菌物質是否為乳酸菌素。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均進行5次平行實驗,數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 17.0的One-way ANOVA程序進行均值計算與方差分析,P<0.05表示具有顯著性差異,數(shù)值以平均值±標準差表示,采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 水果酸奶的抑菌效果

后熟0、12、24、36、48、60和72 h的不同酸奶樣品上清液對指示菌的抑菌效果分別見表1、表2和表3。所有酸奶樣品對3種指示菌都有抑制作用,其中,對枯草芽孢桿菌的抑菌效果尤為顯著,而對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果則相對較弱(P<0.05),隨后熟時間延長,抑菌效果先增強后趨于平緩。這可能是因為酸奶pH較低,隨著后熟時間的延長,pH值不斷降低,從而抑制雜菌的生長,這也是酸奶被稱作最安全食品之一的主要原因。有研究表明當pH降到4.0左右時,在4 ℃低溫下,酸奶中大腸桿菌等致病菌基本不能存活[23]。

2.2 酸對芒果酸奶抑菌效果的影響

分別取后熟0、12、24、36、48、60和72 h添加復配穩(wěn)定劑的芒果酸奶上清液,并將其pH調整至6.0進行抑菌實驗,對指示菌的抑菌效果如圖1所示。

表1 不同酸奶對枯草芽孢桿菌的抑制作用Table 1 Inhibition of different yogurt on B.subtilis

表2 不同酸奶對大腸桿菌的抑制作用Table 2 Inhibition of different yogurt on E.coli

表3 不同酸奶對金黃色葡萄球菌的抑制作用Table 3 Inhibition of different yogurt on S.aureus

圖1 芒果酸奶中有機酸的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of organic acids in mango yogurt注：點線圖代表原液抑菌效果,柱形圖代表酸排除后抑菌效果

排除了酸的抑制作用后,芒果酸奶仍對3種指示菌有抑制作用,且其抑菌規(guī)律與酸共同作用時大致相似。其中,對枯草芽孢桿菌抑制作用最為顯著,大腸桿菌次之,對金黃色葡萄球菌抑制作用尤為微弱(P<0.05)。隨著后熟時間的延長,對3種菌的抑制效果都呈顯著增強趨勢,但沒有出現(xiàn)后期平緩的趨勢。這說明芒果酸奶中除了酸起主要抑制作用,其他物質也有一定的抑菌作用,且這些物質隨著后熟時間的延長,其含量不斷提高。CAI等[20]研究發(fā)現(xiàn)酸類物質對一些細菌的生長有抑制作用,本實驗所用混合乳酸菌種在生長代謝過程中也會不斷產生乳酸等酸類物質,從而對指示菌產生抑制作用,同時隨著芒果酸奶后熟時間的延長,乳酸菌不斷生長繁殖并產生大量次生代謝產物,酸奶的酸度不斷增大,pH不斷降低,抑菌效果增強。

與未排除酸作用的酸奶相比,芒果酸奶的抑菌作用減弱了很多(P<0.05),說明芒果酸奶中有機酸起主要抑菌作用,尤其是前期。但隨著后熟時間越來越長,有機酸的抑菌作用開始趨于平緩,這時,芒果酸奶中其他物質開始逐步提高酸奶的抑菌作用。

2.3 過氧化氫對水果酸奶抑菌效果的影響

分別取后熟0、12、24、36、48、60和72 h的添加了復配穩(wěn)定劑的芒果酸奶上清液,經過氧化氫酶處理并將其pH調至6.0后的抑菌結果如圖2所示。在排除酸作用的基礎上,進一步排除過氧化物作用,后熟時間為0和12 h的芒果酸奶對指示菌皆無抑制作用,而后熟24～72 h的芒果酸奶抑菌效果規(guī)律與只排除酸作用時結果一致,芒果酸奶仍對指示菌有抑制作用,對枯草芽孢桿菌抑制作用最顯著,大腸桿菌次之,對金黃色葡萄球菌抑制作用最為微弱。隨后熟時間延長,對3種菌的抑制效果都呈顯著增強趨勢,在排除酸作用的基礎上,抑菌作用進一步減弱,但仍有效果。有研究表明過氧化氫在合適條件下可以產生活性單氧,有極強的生物致死作用[24],酸奶發(fā)酵過程中,乳酸菌進行次生代謝也會產生少量的過氧化氫產物,從而對指示菌產生一定的抑制作用,但對比圖1和圖2可知,酸奶中產生的過氧化氫的抑菌效果微弱,這與酸奶中過氧化氫濃度較低及自身pH較低有關。由圖2可知，酸奶中除了酸、過氧化氫,還存在其他抑菌物質,且該類抑菌物質是在水果酸奶后熟超過12 h才開始產生的。

圖2 芒果酸奶中過氧化物和乳酸菌素的抑菌效果Fig.2 Bacteriostatic effect of peroxide and lactobacillin in mango yogurt注：點線圖代表原液抑菌效果,柱形圖代表排除酸+過氧化氫抑菌效果

2.4 蛋白酶處理對抑菌作用的影響

后熟0、12、24、36、48、60和72 h并添加了復配穩(wěn)定劑的芒果酸奶上清液,分別用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后的抑菌實驗結果見表4、表5和表6。經3種蛋白酶處理后,后熟0和12 h的芒果酸奶抑菌作用沒有變化,后熟24、36、48、60和72 h的酸奶,隨著后熟時間的延長,抑菌作用下降趨勢逐漸明顯。研究結果與前人研究結果[17, 25-28]有一定的相似性,這說明混合乳酸菌在芒果酸奶發(fā)酵和貯藏過程中產生了乳酸菌素,且是在后熟12 h后(生長總時間22 h)才產生抑菌效果。表4、表5和表6對比可知,乳酸菌素對胰蛋白酶敏感度較高,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶次之。趙鴨美[17]也發(fā)現(xiàn)不同類型的乳酸菌素對不同蛋白酶的敏感程度不同。

本實驗結果表明,芒果酸奶中乳酸等有機酸與乳酸菌素以及過氧化氫起協(xié)同抑菌作用,其抑菌作用具有累加的效果;這和前人的研究結果基本一致[17,25,27-28]。也有研究表明,乳酸菌素和納他霉素[9]、有機酸鹽[29]也具有累加的協(xié)同抑菌作用。

表4 胰蛋白酶對芒果酸奶抑菌效果的影響Table 4 Effect of papain on the bacteriostasis of mango yogurt

表5 胃蛋白酶對芒果酸奶抑菌效果的影響Table 5 Effect of pepsin on the bacteriostasis of mango yogurt

表6 木瓜蛋白酶對芒果酸奶抑菌效果的影響Table 6 Effect of trypsin on the bacteriostasis of mango yogurt

3 結論

酸奶及芒果酸奶對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都有較強的抑制作用,添加復配穩(wěn)定劑對酸奶的抑制作用沒有顯著性影響,而添加芒果醬則能在一定程度上增強酸奶的抑菌效果。

芒果酸奶的抑菌物質主要來源于發(fā)酵過程中乳酸菌產生的乳酸等有機酸、過氧化氫以及乳酸菌素,但乳酸菌素的抑菌作用是在芒果酸奶后熟12 h才開始體現(xiàn)出來。芒果酸奶發(fā)酵過程產生的乳酸菌素對胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶敏感。

芒果酸奶的抑菌作用是乳酸菌素、有機酸及過氧化氫共同作用的結果,這些物質的抑菌效果明顯具有累加效應,且隨著酸奶后熟時間的延長,抑菌物質濃度不斷升高,抑菌效果不斷增強。