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        產(chǎn)谷胱甘肽畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及能量調(diào)控

        2021-04-28 01:49:06高宇豪吳勇杰朱亞鑫付靜徐建國王松濤徐國強張曉梅史勁松許正宏
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年7期
        關(guān)鍵詞:檸檬酸鈉前體半胱氨酸

        高宇豪,吳勇杰,朱亞鑫,付靜,徐建國,王松濤,徐國強,張曉梅,史勁松,許正宏

        1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 3(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 4(江南大學 藥學院,江蘇 無錫,214122) 5(無錫福祈制藥有限公司,江蘇 無錫,214100)

        谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一種三肽活性物質(zhì),廣泛存在于動物、植物和微生物中,具有保護和調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原平衡的作用[1]。GSH相對分子質(zhì)量為307.33,由谷氨酸、甘氨酸及半胱氨酸組成,在各種生物的體內(nèi)含量各不相同,其中在酵母和動物內(nèi)臟中含量較高。GSH在肝病、腎病以及心血管疾病上都具有顯著的療效[2]。GSH的主要特征是其具有一個γ酰胺鍵和一個巰基基團。在大多數(shù)原核和真核生物中由兩步反應生成,第一步由谷氨酸和半胱氨酸在谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的作用下生成谷氨酰半胱氨酸,之后該產(chǎn)物再與甘氨酸在谷胱甘肽合成酶(GS)的作用下反應生成GSH,第一步反應的酶是生成GSH的關(guān)鍵酶,受產(chǎn)物的反饋抑制,兩步酶皆是ATP依賴型,反應均需消耗1分子的ATP[3]。

        目前,GSH合成方法有化學合成法、酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。化學合成法采用3種前體利用化學工藝合成GSH,成本高昂且對環(huán)境造成污染[4]。酶法采用3種前體、ATP及酶反應生成GSH,此法核心是篩選出具有高活性的合成酶,但成本高[5-7]。發(fā)酵法是微生物利用廉價的原料生產(chǎn)積累高濃度的GSH,然后分離純化,成本低、純度高、無污染,是目前生產(chǎn)GSH的主要方法[8]。通常采用誘變或者基因工程來提高酶的活性,或通過優(yōu)化發(fā)酵條件提高前體的利用[9-11]。由于酵母中GSH含量較高,遺傳背景清晰,所以經(jīng)常被用作生產(chǎn)GSH的優(yōu)良宿主。半胱氨酸是提高GSH的關(guān)鍵氨基酸,但在進行高密度發(fā)酵生產(chǎn)時,細胞通過代謝合成的半胱氨酸遠不能滿足GSH合成的需要[10]。因此,外源添加半胱氨酸是一種有效策略,也確實實現(xiàn)了GSH的大規(guī)模生產(chǎn)[12]。然而當半胱氨酸添加過量時,使得充當能量載體的ATP成為GSH生產(chǎn)的限制因素。

        為解決此問題,研究人員通過在培養(yǎng)基中直接添加能量代謝底物或是通過代謝改造提高胞內(nèi)ATP的再生來提高胞內(nèi)GSH或是其余高耗能生物產(chǎn)物的積累[13-16]。GSH的合成一個巨大的耗能反應,高密度發(fā)酵的方式使ATP成為關(guān)鍵的限制因素。畢赤酵母是重組蛋白表達的優(yōu)良宿主,由于其較易實現(xiàn)高密度發(fā)酵且具有食品安全級狀態(tài),近些年來常用作生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物。本實驗為獲得高產(chǎn)GSH的畢赤酵母菌株,通過在畢赤酵母GS115中異源表達來自釀酒酵母的Scgsh1(編碼γ-GCS)和Scgsh2(編碼GS)以增強其合成路徑,在添加前體物質(zhì)的條件下獲得了GSH的過量積累,之后對輔能量底物檸檬酸鈉的條件進行了優(yōu)化,并進行放大發(fā)酵驗證。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物

        菌株:PichiapastorisGS115、SaccharomycescerevisiaeBY4741、質(zhì)粒擴增保藏菌株EscherichiacoliJM109。均來自實驗室,-80 ℃保藏。

        質(zhì)粒和引物:pPIC3.5K來自本實驗室保藏,構(gòu)建所用質(zhì)粒皆為本課題組在此基礎(chǔ)上構(gòu)建。Scgsh1基因(Gene ID:853344)和Scgsh2基因(Gene ID:854108)經(jīng)S.cerevisiaeBY4741基因組PCR擴增后獲取,載體構(gòu)建成功后的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)提取質(zhì)粒送去天霖生物科技有限公司測序驗證,測序結(jié)果與NCBI上序列一致的重組質(zhì)粒將用于后續(xù)菌株的構(gòu)建。所用引物皆為金唯智生物科技公司合成,如表1所示。

        表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primers used in this study

        1.1.2 酶和試劑

        質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒,上海捷瑞生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶,Takara公司;ATP含量測定試劑盒,碧云天生物技術(shù)。

        1.1.3 培養(yǎng)基

        LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 10;固體另加2 g/L的瓊脂。

        YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,酵母膏10,蛋白胨20;固體另加2 g/L的瓊脂。

        MD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,YNB 13.4;固體另加2 g/L的瓊脂。

        種子培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基,搖瓶水平的發(fā)酵培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基。

        YPDZ培養(yǎng)基(g/L):在YPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,加入Zeocin使之質(zhì)量濃度為100 μg/L。

        上罐培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 50,酵母粉 5,(NH4)2SO411,K2HPO47,MgSO45,CaCl20.5,KCl 0.5。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建方法

        構(gòu)建以PGAP為啟動子、TAOX1為終止子的組成型表達菌株。首先以GAP-F/GAP-R為引物擴增出基因組上的PGAP啟動子序列。采用SacI及BamH I酶切pPIC 3.5K以去除PAOX1片段并用PGAP序列代替得到組成型表達的質(zhì)粒,將其命名為pPICKT。以S.cerevisiaeBY4741的基因組為模板,分別以GSH1F/GSH1R、GSH2F/GSH2R PCR擴增出目的基因Scgsh1和Scgsh2片段連接至pPICKT中,構(gòu)成P1和P2質(zhì)粒。后用G1F/G1R和TF/TR分別擴增P1質(zhì)粒上的PGAP-Scgsh1與TAox1片段,后采用諾唯贊C113多片段同源重組連接試劑盒連接入P2質(zhì)粒中,獲得同時含有Scgsh1和Scgsh2表達單元的質(zhì)粒pP-PGAP-Scgsh1-Scgsh2,即P3質(zhì)粒。以上構(gòu)建質(zhì)粒過程均轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中,在含有100 mg/L的氨芐青霉素LB抗性平板上進行篩選,獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR驗證及測序,得到正確的轉(zhuǎn)化子。

        1.2.2 電轉(zhuǎn)化及篩選方法

        將質(zhì)粒pP-PGAP、P1及P3均用SalI線性化后采用根據(jù)手冊(Invitrogen)通過電轉(zhuǎn)法將線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母,涂布于含有組氨酸缺陷型的MD平板,于30 ℃下孵育2~3 d。將長出的菌落點至高質(zhì)量濃度G418(4 mg/mL)中,長出的較大的菌落并提交基因組驗證后即可獲得含有高拷貝基因數(shù)的目的菌株。

        1.2.3 培養(yǎng)方法

        搖瓶發(fā)酵:種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均為YPD培養(yǎng)基。將菌株從甘油管挑至YPD平板上劃線,30 ℃培養(yǎng)2~3 d,長出的單菌落挑至含有10 mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中,30 ℃培養(yǎng)16~18 h,之后以適當?shù)臐舛冉臃N至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

        發(fā)酵罐發(fā)酵:將種子培養(yǎng)基培養(yǎng)16~18 h,以體積分數(shù)為10%的接種量接入100 L發(fā)酵罐中。待培養(yǎng)基pH降至5.5時,流加50%氨水使發(fā)酵過程的pH始終維持在5.5。1 L培養(yǎng)基中含有10 mL PTM1,待初始培養(yǎng)基中的糖降至5 g/L時,補加700 g/L的葡萄糖,使乙醇質(zhì)量濃度始終在3 g/L以下。當發(fā)酵液OD600達到250,即發(fā)酵48 h時,投料終濃度為10 mmol/L氨基酸前體混合液。定時取樣,測生物量、GSH質(zhì)量濃度、甘油、還原糖及乙醇質(zhì)量濃度。

        1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物檢測方法

        生物量檢測:取適量檢測點的樣品稀釋至OD600值為0.2~0.8,于600 nm處測取吸光度。

        GSH提取及檢測:將發(fā)酵液進行12 000 r/min離心2 min以收集菌體。超純水振蕩懸浮2次以去除培養(yǎng)基的影響。采用40%乙醇提取,30 ℃ 220 r/min振蕩孵育2 h,8 000 r/min離心5 min,即得到富含GSH的上清液。GSH的檢測采用Alloxan法[17]。

        ATP含量檢測:取適量16、20、24和28 h樣品,離心后用pH 6的Tris-HCl溶液振蕩懸浮2次,超聲破碎,上清液采用ATP檢測試劑盒檢測ATP[18]。

        甘油、乙醇、還原糖檢測:離心后的上清液用SBA-40D檢測乙醇質(zhì)量濃度,使用西爾曼生物傳感器測甘油含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 Scgsh1單獨表達及Scgsh1與Scgsh2共表達對畢赤酵母積累GSH的影響

        2.1.1 釀酒酵母Scgsh1和Scgsh2的克隆

        為獲得釀酒酵母谷氨酰半胱氨酸合成酶基因Scgsh1及谷胱甘肽合成酶基因Scgsh2,以釀酒酵母BY4741基因組為模板進行PCR擴增,結(jié)果如圖1-a、圖1-b所示。產(chǎn)物回收后送至天霖生物科技有限公司測序,測序結(jié)果與NCBI上序列(Gene ID:853344、Gene ID:854108)進行比對,序列完全一致,因此得到Scgsh1和Scgsh2的基因序列,按照1.2.1小節(jié)進行菌株構(gòu)建。

        2.1.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建

        將pPIC3.5KT、pPIC3.5KT-Scgsh1、pPIC3.5KT-Scgsh1-Scgsh2線性化電轉(zhuǎn)至GS115中,使其整合在his4基因處,將其分別命名為G1、G2、G3。由于整合至基因組的質(zhì)粒帶有卡那抗性基因而使目的菌株帶有G418抗性,且隨著整合拷貝數(shù)的增加,菌株抗G418的能力越強。為此,將在組氨酸缺陷型平板上長出的單菌落點板至高質(zhì)量濃度的G418(4 mg/mL)中,長出的轉(zhuǎn)化子經(jīng)提基因組驗證正確后即為目的菌株。提取高抗G418菌株的基因組,分別采用YZGF、YZGR和YZGGF、YZGGR引物驗證,驗證結(jié)果如圖1-c、1-d所示,從NCBI數(shù)據(jù)庫得知Scgsh1和Scgsh2大小分別為2 037和1 476 bp,采用設(shè)計的驗證引物從G2、G3基因組PCR理論應得到2 240 bp和2 964 bp片段,電泳結(jié)果證明基因已整合入基因組中。

        a-M-5 kb marker;1,2-Scgsh1基因PCR擴增;b-M-5 kb marker;1,2-Scgsh2基因PCR擴增;c-M-5 kb marker;1,2-G2菌株提基因組驗證引物驗證;d-M-5 kb marker;1,2-G3菌株提基因組驗證引物驗證圖1 目的基因的PCR擴增電泳圖和重組菌基因組驗證圖Fig.1 Electrophoresis map of the target gene amplified by PCR and verification map of recombinant strain genome

        2.1.3 重組菌發(fā)酵特性評價

        對GS115、G1、G2、G3進行搖瓶發(fā)酵,結(jié)果如圖2所示。從菌株生長來看,菌株皆在20 h達到穩(wěn)定期。G1、G2、G3最高生物量較對照GS115分別提高6%、5.61%、10.7%,可能的原因是質(zhì)粒的整合彌補了GS115組氨酸缺陷的影響,且畢赤酵母在好氧發(fā)酵過程中胞內(nèi)氧化壓力較大,GSH的過量合成也可協(xié)調(diào)胞內(nèi)的氧化還原平衡。工程菌G2、G3在30 h的產(chǎn)量達到最高,G2菌株在發(fā)酵30 h 后的GSH質(zhì)量濃度為(120.47±0.61) mg/L,相較于GS115(61.52±0.31) mg/L提高了1.95倍。G3菌株發(fā)酵30 h后的 GSH質(zhì)量濃度為(141.96±2.15) mg/L,產(chǎn)量相較對照提高2.31倍。工程菌GSH在細胞內(nèi)的得率也獲得提高,G2、G3 最高達到4.48和5.07 mg/OD,較對照GS115(2.52 mg/OD)分別提高1.77倍和2.01倍。相比G2菌株而言,G3菌株GSH產(chǎn)量的提高幅度有限,其一可能是由于Scgsh1編碼的γ-GCS是GSH合成過程中的關(guān)鍵酶,對GSH的合成起決定性作用,GSH的過量積累會對其造成反饋抑制[19]。其二可能是胞內(nèi)3種前體的供應不足,導致GSH的合成效率受限。

        a-生物量;b-GSH質(zhì)量濃度;c-GSH得率;d-添加氨基酸前體時菌株發(fā)酵結(jié)果圖2 重組菌株搖瓶發(fā)酵性能圖Fig.2 Fermentation performance by recombinant strain

        為提高GSH的合成效率,在發(fā)酵0 h時添加了終濃度為10 mmol/L的甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸的混合液。從圖2-d中可以看出氨基酸前體的加入對菌株生長有一定抑制作用,可能是前體物質(zhì)中的半胱氨酸對菌株有毒害作用所致,但前體的加入確實極大程度提高了菌體合成GSH的能力,這也與文獻報道的一致[20]。在發(fā)酵30 h,G2、G3菌株產(chǎn)量分別達至(261.66±21.7)和(302.27±5.06)mg/L,較對照(104.96±3.19) mg/L分別提高2.49倍和2.88倍,且G3菌株胞內(nèi)GSH得率提升至11.79 mg/OD,故以G3為目的菌株做后續(xù)實驗。

        2.2 輔能量底物檸檬酸鈉對G3菌株積累GSH的影響

        外源添加氨基酸前體是提高GSH產(chǎn)量有效手段,且上面實驗結(jié)果也已證實。但外源氨基酸前體的過量添加會使得ATP成為主要的限制性因素。從外源直接添加不失為一種有效手段,但對于工業(yè)上的放大發(fā)酵是不經(jīng)濟的。在這里,我們外源添加廉價的輔能量底物檸檬酸鈉,探究能量對菌體合成GSH的影響,結(jié)果如圖3-a、3-b所示。

        檸檬酸鈉的加入對G3菌株的生長無明顯影響,對于菌株發(fā)酵產(chǎn)GSH有促進作用,對檸檬酸鈉的添加時間及質(zhì)量濃度進行優(yōu)化,確定最佳添加時間為12 h,添加質(zhì)量濃度為4 g/L,產(chǎn)量由(308.97±5.51) mg/L提升至(371.12±8.47) mg/L,提升20.1%,得率最高可達到14.41 mg/OD,較添加前提高13.41%。

        a-檸檬酸鈉添加時間優(yōu)化;b-檸檬酸鈉添加濃度優(yōu)化;c-胞內(nèi)ATP的變化曲線圖3 檸檬酸鈉添加對胞內(nèi)GSH和ATP含量影響圖Fig.3 Effect of sodium citrate addition on intracellular GSH and ATP content

        之后探究了檸檬酸鈉添加后對胞內(nèi)ATP含量的影響,結(jié)果如圖3-c所示,添加檸檬酸鈉后菌株16~28 h內(nèi)胞內(nèi)的ATP的含量均比對照要高,這是由于檸檬酸鈉的加入,強化了三羧酸循環(huán)路徑,從而提高胞內(nèi)ATP的含量。其中在ATP含量20 h達到了最高值,之后迅速下降,這可能是由于在此時期菌體生長進入平臺期,此時大量的GSH被合成,消耗了大量的ATP。綜上,搖瓶中檸檬酸鈉的添加在一定程度上解除了氨基酸過量情況下ATP不足的限制。

        2.3 重組菌株上罐發(fā)酵驗證

        為進一步提高GSH產(chǎn)量,作者在100 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件下開展了畢赤酵母工程菌的罐上發(fā)酵實驗。由于氨基酸前體溶液的添加對菌株生長有一定抑制作用,在這里采用補料分批發(fā)酵的方式先提高菌體生物量后單次補加前體混合液的兩階段合成GSH。發(fā)酵結(jié)果如圖4所示,全程控制乙醇含量調(diào)控補料速率,使乙醇含量始終在3 g/L以下。

        圖4 G3菌株在100 L發(fā)酵罐水平的發(fā)酵性能Fig.4 Fermentation profile of G3 in 100 L fermentor

        酵母發(fā)酵產(chǎn)2,3-丁二醇時,甘油是作為NAD+再生的主要副產(chǎn)物存在[21]。GSH是胞內(nèi)的協(xié)調(diào)氧化還原平衡的物質(zhì),為此,我們在發(fā)酵過程中檢測甘油的含量,發(fā)酵液中甘油的含量始終在0.3 g/L,也就是說甘油并不是GSH合成時的主要副產(chǎn)物。G3菌株菌體生物量在40 h處于對數(shù)生長后期,在48 h到達生長穩(wěn)定期,此時的生物量OD600達到257,較搖瓶發(fā)酵水平的生物量OD600(28.4)提高9.05倍,同時葡萄糖在16 h時被迅速消耗盡,剩余量為0.36 g/L。GSH作為初級代謝產(chǎn)物伴隨菌體生長積累,在投料氨基酸前體混合液之前在48 h達到728 mg/L。在此時投料氨基酸溶液,GSH的合成效率迅速增加,在68 h時GSH的產(chǎn)量達至最高為2 000 mg/L,較搖瓶水平最高產(chǎn)量(302.27 mg/L)提高了6.62倍。以上結(jié)果顯示,兩階段合成法對促進GSH的產(chǎn)生有顯著作用。WANG等[20]通過控制呼吸熵優(yōu)化葡萄糖的補料速率,實現(xiàn)生長與合成分開,使GSH含量顯著提高,本文的研究結(jié)果也與之相似。

        3 結(jié)論

        巴斯德畢赤酵母作為蛋白質(zhì)表達的強大系統(tǒng)而受到廣泛的關(guān)注。除蛋白質(zhì)外,近些年還用于生產(chǎn)其他增值產(chǎn)品,例如類胡蘿卜素、維生素K2等等,從而證明了巴斯德畢赤酵母從單個基因的有效表達已擴展到合成途徑的表達,以生產(chǎn)附加值高的化合物[22-23]。本研究以畢赤酵母GS115為宿主菌株,異源整合表達來源于釀酒酵母BY4741的Scgsh1及Scgsh2基因,從而強化了GSH在畢赤酵母中的合成路徑,再添加前體氨基酸的條件下使GSH的產(chǎn)量由(104.69±3.19) mg/L提升至(302.27±5.06) mg/L,且細胞內(nèi)的得率也大幅提高。之后為減輕氨基酸前體過量時能量的限制,采用添加輔能量底物檸檬酸鈉的策略,GSH產(chǎn)量進一步提升至(371.12±8.47) mg/L。為進一步提高GSH產(chǎn)量,采用了100 L發(fā)酵罐的放大發(fā)酵,并控制乙醇質(zhì)量濃度優(yōu)化補糖速率,進而使OD600最高可達至257,最高產(chǎn)量可達2 000 mg/L,較搖瓶水平分別提高9.05倍和6.62倍。綜上可以看出GSH合成路徑的強化及能量供應對提升菌體內(nèi)GSH的積累具有顯著作用,同時也為內(nèi)源性代謝改造提升胞內(nèi)能量供應促進GSH積累提供了思路和理論基礎(chǔ)。但本研究尚未解除GSH過量積累對谷胱甘肽合成酶系的反饋抑制,今后將著重探究調(diào)控胞內(nèi)能量代謝及解除GSH對胞內(nèi)合成酶系的反饋抑制對GSH積累的影響。

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