歐維正 雷毅娜 王瓊 秦萬 唐發(fā)琴 王燕 蔡翠

(貴陽市公共衛(wèi)生救治中心，貴州 貴陽 550003)

結(jié)核病(TB)是結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的重大傳染性疾病[1]，在國內(nèi)，分子診斷技術(shù)多以痰樣本為研究對象，而對EPTB的應(yīng)用報道不多，特別是針對肺外病灶組織樣本的研究甚少。肺外病灶組織樣本為膿液、穿刺液和肉芽組織等，與肺結(jié)核(PTB)患者的痰樣本在性質(zhì)方面存在較大差異，不同樣本類型會對試驗結(jié)果產(chǎn)生極大影響，再加上不同的樣本處理技術(shù)也會不同程度地影響診斷準確性。本研究將分枝桿菌核酸PCR-熒光探針檢測(MTB-NTM-PCR)、RNA 恒溫擴增實時熒光檢測(TB-SAT)、多色巢式熒光定量PCR(Xpert MTB/RIF)3種分子診斷技術(shù)與傳統(tǒng)的抗酸染色和羅氏培養(yǎng)同步對肺外病灶組織樣本進行檢測對比，以評估3種分子診斷技術(shù)對EPTB診斷的價值。報告如下。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2017年6月至2018年9月本院送檢淺表淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)(骨)、胸腰椎、周身包塊等病灶組織的穿刺液或分泌物的收治患者119例作為研究對象，其中，淺表淋巴結(jié)病灶組織穿刺液或分泌物30例，關(guān)節(jié)(骨)病灶組織穿刺液或分泌物41例，胸腰椎病灶組織穿刺液或分泌物23例，周身包塊病灶組織穿刺液或分泌物25例。全部患者均由臨床醫(yī)生依照參考文獻[2-4]診斷及鑒別診斷，診斷EPTB88例為試驗組，其中，男52例，女36例，年齡(38.4±18.5)歲；排除EPTB31例為對照組，其中，男23例，女8例，年齡(40.2±19.7)歲。診斷不明確的不納入本研究。試劑和儀器：抗酸染色試劑為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品[注冊號為粵珠食藥監(jiān)械(準)字2013第1400066號]；羅氏培養(yǎng)基和對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基為珠海市銀科醫(yī)學工程有限公司產(chǎn)品[注冊號為粵食藥監(jiān)械(準)字2012第2400717號]；MTB-NTM-PCR試劑為博奧生物有限公司的“晶芯?分枝桿菌核酸檢測(PCR-熒光探針法)試劑盒”[注冊號為國食藥監(jiān)械(準)字2010第3400530號]；TB-SAT試劑為上海仁度生物科技有限公司的“結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(RNA恒溫擴增)”[注冊號為國械注準20153401875]；Xpert MTB/RIF檢測試劑為美國Cepheid公司的Gene Xpert?MTB/RIF試劑盒(注冊號為國食藥監(jiān)械(進)字2014第3401153號)。

1.2方法 (1)抗酸染色：將送檢的樣本按檢驗規(guī)程[5]進行萋-尼氏抗酸染色檢測?？顾釛U菌陰性為連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌?？顾釛U菌陽性為連續(xù)觀察300個不同視野至少發(fā)現(xiàn)1條抗酸桿菌。(2)羅氏培養(yǎng)：將送檢的樣本用1～2倍樣本體積的4%NaOH處理，參照檢驗規(guī)程[5]進行羅氏培養(yǎng)，若滿8周仍無菌生長即報告培養(yǎng)陰性。對分離到的菌株參照檢驗規(guī)程[5]進行PNB試驗，如菌株在PNB培養(yǎng)基上生長，鑒定為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，反之為MTB。(3)MTB-NTM-PCR檢測：將送檢的樣本用1～2倍樣本體積的4%NaOH處理，按工作手冊[6]進行MTB-NTM-PCR檢測。結(jié)果判斷：對于MTB-DNA，樣本擴增曲線呈S型，且Ct值<36判定為陽性；對于NTM-DNA，樣本擴增曲線呈S型，且Ct值<40判定為陽性；MTB-DNA和NTM-DNA均為陽性時，判MTB-DNA陽性；MTB-DNA和NTM-DNA均為陰性時，判無分枝桿菌檢出。以試劑盒自帶的陰陽性對照作為質(zhì)控。(4)TB-SAT檢測：進行MTB-NTM-PCR檢測的同時，將4%NaOH處理的樣本按檢驗規(guī)程[5]進行TB-SAT檢測。結(jié)果判斷：Dt值<40判定為MTB-RNA陽性，Dt值≥40或無數(shù)值判定為MTB-RNA陰性。以試劑盒自帶的陰陽性對照作為質(zhì)控。(5)Xpert MTB/RIF檢測：取1 ml樣本置于有螺旋蓋的前處理管中，然后加入相當于2倍樣本體積的處理液，旋緊前處理管，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使樣本充分液化。打開反應(yīng)盒，取2 ml處理后樣品從加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒置于檢測模塊。儀器開始進行自動化檢測。反應(yīng)結(jié)束后，檢測結(jié)果可直接在檢測系統(tǒng)窗口下觀察。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。3種分子診斷技術(shù)與傳統(tǒng)抗酸染色+羅氏培養(yǎng)的MTB陽性率比較，以及以臨床診斷為金標準，3種分子診斷技術(shù)診斷EPTB的靈敏性比較采用χ2檢驗，p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；5種方法的檢測結(jié)果與試驗組和對照組的一致性比較采用Kappa檢驗，Kappa值0～0.20示極低的一致性，0.21～0.40示一般的一致性，0.41～0.60示中等的一致性，0.61～0.80示高度的一致性，0.81～1示幾乎完全一致。

2 結(jié) 果

2.15種方法對119例肺外病灶組織樣本的檢測結(jié)果 119例肺外病灶組織樣本抗酸染色陽性11例；羅氏培養(yǎng)分離到28株菌株，經(jīng)PNB試驗鑒定，1例為NTM(其患者抗酸染色樣本亦為陽性)，其余均為MTB，試驗組抗酸染色+羅氏培養(yǎng)的陽性患者實為30例；MTB-NTM-PCR檢測，MTB-DNA陽性58例，NTM-DNA陽性1例(亦為上述NTM患者樣本)；TB-SAT檢測，MTB-RNA陽性46例；Xpert MTB/RIF檢測，MTB-DNA陽性69例，利福平(RIF)耐藥12例，耐藥率17.39%(12/69)。對比傳統(tǒng)的抗酸染色+羅氏培養(yǎng)方法，3種分子診斷技術(shù)檢測MTB的陽性率比較。見表1。

表1 抗酸染色+羅氏培養(yǎng)與3種分子診斷技術(shù)檢測MTB的陽性率比較

2.25種方法檢測結(jié)果的一致性及診斷效能比較 以臨床診斷為金標準，5種方法檢測結(jié)果對試驗組和對照組的一致性比較，診斷EPTB的效能比較。見表2、表3。

表2 5種方法檢測結(jié)果對試驗組與對照組的一致性比較

表3 比較5種檢測方法對EPTB的診斷效能(%)

3 討 論

研究顯示，95%以上的利福平耐藥MTB有rpoB基因突變，同時所有的利福平敏感MTB在rpoB基因都有相同的核酸序列，說明通過檢測rpoB基因可以判斷是否存在MTB及利福平耐藥[7-8]。Xpert MTB/RIF是TB診斷領(lǐng)域的新技術(shù)，其在EPTB診斷中的價值尚缺乏統(tǒng)一認識，國外已有研究中納入的樣本量普遍偏小，且部分研究未給出詳細的針對不同器官EPTB的數(shù)據(jù)[9]。國內(nèi)應(yīng)用該技術(shù)檢測MTB，以臨床診斷為金標準，竺祖軍等[10]診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的靈敏性為82.09%(55/67)，周正等[11]診斷脊柱結(jié)核的靈敏性為76.38%(55/72)，本研究以肺外病灶組織樣本診斷EPTB的靈敏性為78.41%(69/88)，三者研究結(jié)果基本相符，顯示Xpert MTB/RIF對EPTB有較高的病原學診斷率。

本研究Xpert MTB/RIF檢測肺外病灶組織樣本MTB的RIF耐藥率為17.39%(12/69)，低于本地區(qū)痰樣本的33.22%。TB-SAT是基于TMA(transcription mediated amplification)恒溫擴增技術(shù)發(fā)展起來的一項新的核酸檢測技術(shù)，以MTB特異的16S rRNA為檢測靶標，在同一溫度(42℃)，以RNA為起始模板，通過M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該 DNA拷貝產(chǎn)生多個(100～1 000)RNA拷貝；每個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進入下一輪擴增循環(huán)；同時帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀實時捕獲，直觀地反映擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生。TB-SAT具有檢測速度快、效率高等特點。本研究該技術(shù)檢測肺外病灶組織樣本診斷EPTB的靈敏性為52.27%(46/88)。MTB-NTM-PCR是利用分枝桿菌屬及MTB的特異性引物，采用雙重實時熒光PCR技術(shù)和TaqMan探針技術(shù)實現(xiàn)對MTB和NTM的同時檢測。該檢測方法的優(yōu)勢在于可以快速對TB和NTM病進行鑒別診斷。本研究有1例MTB-NTM-PCR檢測NTM-DNA陽性的樣本，其抗酸染色陽性，羅氏培養(yǎng)分離菌株經(jīng)PNB試驗鑒定亦為NTM，而Xpert MTB/RIF和TB-SAT檢測均為陰性。本研究顯示，3種分子診斷技術(shù)對EPTB的診斷特異性均為100%，高于傳統(tǒng)的抗酸染色和羅氏培養(yǎng)方法。本研究MTB-NTM-PCR、TB-SAT和Xpert MTB/RIF 3種分子診斷技術(shù)檢測肺外病灶組織樣本MTB的陽性率分別為48.74%(58/119)、38.66%(46/119)和57.98%(69/119)。顯示3種分子診斷技術(shù)檢測MTB對于肺外病灶組織樣本和痰樣本沒有本質(zhì)的差異。本研究MTB-NTM-PCR檢測肺外病灶組織樣本的MTB陽性率則高于本院臨床總體樣本MTB陽性率的22.72%(3966/17452)。表1顯示3種分子診斷技術(shù)檢測MTB的陽性率均高于傳統(tǒng)的抗酸染色+羅氏培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學意義 (p<0.05)，并且表2顯示3種分子診斷技術(shù)檢測結(jié)果對試驗組和對照組的一致性優(yōu)于傳統(tǒng)方法。本研究以臨床診斷為金標準，3種分子診斷技術(shù)的靈敏性和特異性明顯高于傳統(tǒng)方法，顯示了分子診斷技術(shù)對EPTB診斷價值的優(yōu)勢。3種分子診斷技術(shù)的靈敏性兩兩比較，MTB-NTM-PCR與TB-SAT、Xpert MTB/RIF之間差異均無統(tǒng)計學意義，而TB-SAT與Xpert MTB/RIF之間差異有統(tǒng)計學意義。TB-SAT可能因只能檢測桿菌，實驗過程人為因素等原因會導(dǎo)致靈敏性下降，但若控制好實驗條件，檢測結(jié)果不失為TB治療有效與否的重要參考。

綜上所述，MTB-NTM-PCR、TB-SAT和Xpert MTB/RIF對肺外病灶組織樣本MTB檢測的靈敏性、特異性明顯高于傳統(tǒng)的抗酸染色和羅氏培養(yǎng)，其中Xpert MTB/RIF的檢測靈敏性最高，并與臨床診斷有高度的一致性。3種分子診斷技術(shù)均可推廣應(yīng)用于肺外病灶組織樣本MTB的快速檢測，并將有助于提高EPTB的病原學診斷率。