鄢雯 李囡 王世全 曾令娥 劉立新

(首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)學(xué)系,北京 101300)

腎臟纖維化是高血壓引起靶器官損傷的重要病理變化，主要由于大量膠原蛋白沉積，最終取代正常腎臟結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腎小球硬化及腎小管間質(zhì)的纖維化，造成腎臟功能進(jìn)行性喪失[1-2]。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解的主要途徑之一。β5i是UPS蛋白酶解中心的核心催化亞基[3]，可產(chǎn)生糜蛋白酶樣活性。我們發(fā)現(xiàn)免疫蛋白酶體亞基β5i參與鹽敏感型高血壓的小鼠心肌重構(gòu)的病理過(guò)程[4]，但其在腎臟纖維化的作用尚不甚清楚。本研究通過(guò)建立醋酸脫氧皮質(zhì)酮(desoxycorticosterone acetate,DOCA)-鹽敏感高血壓模型，以特異性蛋白酶體抑制劑PR957進(jìn)行治療，通過(guò)對(duì)小鼠血壓及腎組織纖維化指標(biāo)表達(dá)變化的研究，觀察和分析β5i對(duì)DOCA-鹽敏感型高血壓小鼠腎臟纖維化的影響。報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J小鼠，雄性，8～10周齡，體重(23±2)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(京)2012～0001。遵照首都醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)倫理標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)前采用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)小鼠1周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水和進(jìn)食。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 (1)主要試劑為：DOCA(Sigma)；PR-957(Selleck Chemicals)；總RNA提取及及TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)；Trizol(Invitrogen)；SYBR Green(TaKaRa)；Masson三色染色試劑盒(Solarbio)。(2)主要儀器為：BP 98A鼠尾套管血壓計(jì)(Softron)；real-time聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(Bio-Rad)；TP1020半封閉全自動(dòng)組織脫水機(jī)(Leica)。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型復(fù)制及分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為四組(每組n=8)：假手術(shù)組，PR-957組，DOCA-salt組和DOCA-salt+PR-957組。模型制備步驟[5]：(1)三溴乙醇(12 ml/kg)腹腔注射麻醉小鼠，在位于脊柱左側(cè)肋緣下1 cm處作一長(zhǎng)約1 cm的切口，暴露腎臟，結(jié)扎腎門(mén)處血管，剝離腎被膜，切除左腎后縫合肌肉和皮膚；(2)植入DOCA藥片前一天，PR-957組和DOCA-salt+PR-957組皮下開(kāi)始注射PR-957(12 mg/kg，每周4次)，其余兩組皮下注射DMSO與生理鹽水的混合液；(3)腎臟切除2天后，DOCA-salt組和DOCA-salt+PR-957組在右肩背部皮下植入DOCA藥片并飲用含0.9% NaCl和0.2% KCl的高鹽水3周，其余兩組正常飲水；(4)術(shù)后，每隔2天在固定時(shí)間進(jìn)行鼠尾套管血壓測(cè)定。

1.3.2血壓測(cè)量 采用BP-98A鼠尾套管血壓儀進(jìn)行血壓測(cè)量。實(shí)驗(yàn)前1周在上午8～11點(diǎn)固定時(shí)間監(jiān)測(cè)小鼠基礎(chǔ)血壓2次，以減少實(shí)驗(yàn)小鼠因緊張等不適造成的實(shí)驗(yàn)誤差。在術(shù)后每隔2 d在相同時(shí)間進(jìn)行血壓測(cè)定，每只實(shí)驗(yàn)小鼠每次重復(fù)測(cè)量8～10遍血壓，記錄收縮壓值并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3腎臟取材 小鼠麻醉后，剪取小鼠腎臟，用濾紙吸干腎臟表面的水分稱(chēng)重并記錄，去掉包膜及周?chē)窘M織,稱(chēng)重記錄腎重/體重指數(shù) (kidney weight/body weight,KW/BW) ,提RNA的腎臟組織用液氮冷凍后保存于-80℃冰箱。用4 %多聚甲醛固定腎臟，然后用石蠟包埋、切片，脫蠟后進(jìn)行Masson染色和免疫組化分析。

1.3.4腎組織病理檢查 將多聚甲醛固定的腎組織制成3 μm厚的石蠟切片，行HE及Masson染色，用顯微鏡觀察并采集圖像，Masson染色結(jié)果運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描圖像并分析膠原沉積情況。

1.3.5腎臟組織RNA的提取及RT-PCR 腎臟組織RNA的提取及RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。引物的設(shè)計(jì)及合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血壓情況 為了探討PR-957對(duì)小鼠血壓的影響，我們?cè)谠炷Ｇ皟商熘猎炷：?周每隔2天進(jìn)行血壓測(cè)定。與Sham組相比，埋入DOCA藥片和高鹽飲食 4 d后，DOCA-salt組小鼠血壓開(kāi)始明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而DOCA-salt+PR-957組則明顯降低DOCA-salt誘導(dǎo)的血壓升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：DOCA-salt處理后，檢測(cè)小鼠的動(dòng)脈收縮壓(Systolic Arterial Pressure)變化情況(n=8～10次)。*P<0.05與Sham組比較；#P<0.05與DOCA-salt組比較。圖1 各組小鼠血壓的變化

2.2各組小鼠腎臟體積和腎質(zhì)量/體質(zhì)量 與Sham組比較，DOCA-salt處理后腎臟體積和KW/BW比率增高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，腹部皮下注射PR-957可明顯抑制DOCA-salt誘導(dǎo)的腎臟體積和KW/BW比率增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：(A)DOCA-salt處理21 d后，腎臟大體照片；(B)DOCA-salt處理21 d后，各組小鼠的KW/BW比值(n=5-6)；*P<0.05與Sham組比較；#P<0.05與DOCA-salt組比較。圖2 各組小鼠腎體積和腎質(zhì)量/體質(zhì)量比值

2.3腎組織病理改變 HE及Masson染色可見(jiàn)sham組小鼠腎小管結(jié)構(gòu)清晰完整，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整,間質(zhì)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；DOCA-salt組小鼠腎小管腔擴(kuò)張明顯，腎小管基底膜不規(guī)則增厚,腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀改變,細(xì)胞萎縮和脫落，小管間質(zhì)細(xì)胞增多伴有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，間質(zhì)區(qū)增寬，腎小管間質(zhì)膠原沉積增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ；DOCA-salt+PR957組小鼠腎臟病變有不同程度的改善,腎小管間質(zhì)膠原沉積明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕,空泡狀改變不明顯。證實(shí)PR-957可以明顯降低DOCA-salt引起的腎臟炎癥反應(yīng)和纖維化。見(jiàn)圖3。

注：(A)DOCA-salt處理并腹部皮下注射PR-957后，腎臟組織進(jìn)行Masson染色(×200倍)(B)DOCA-salt處理并腹部皮下注射PR-957后，腎臟組織進(jìn)行HE染色(×200倍)。圖3 各組小鼠腎組織病理學(xué)變化

2.4qPCR結(jié)果 與Sham組相比，DOCA-salt組小鼠腎組織纖維化因子Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和炎癥因子ⅠL-1β、ⅠL-6、TNF-α的表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PR957干預(yù)后，膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、ⅠL-1β、ⅠL-6和TNF-α的表達(dá)較DOCA-salt組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。見(jiàn)圖4。

注：(A)DOCA-salt處理并腹部皮下注射PR-957后， qPCR檢測(cè)腎臟Collegen Ⅰ和CollegenⅢ水平。(B)qPCR檢測(cè)腎臟炎癥因子ⅠL-1β、ⅠL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA水平(n=6)。*P<0.05與Sham組比較；**P<0.01與Sham組比較；#P<0.05與DOCA-salt組比較。圖4 蛋白酶體抑制劑PR-957減輕DOCA-salt引起的炎癥反應(yīng)

3 討 論

高血壓病是目前臨床上最常見(jiàn)的慢性病，鹽敏感性高血壓是原發(fā)性高血壓的一種常見(jiàn)類(lèi)型。DOCA為醋酸脫氧皮質(zhì)酮，有醛固酮樣的作用，DOCA鹽敏感高血壓模型類(lèi)似于人類(lèi)繼發(fā)性高血壓病的原發(fā)性醛固酮增多癥，與水鈉潴留、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活、血管活性肽物質(zhì)增多等多種機(jī)制有關(guān)[7]。我國(guó)成人中患有原發(fā)性高血壓病的患者約10%～15%會(huì)發(fā)展到慢性腎衰竭。在高血壓患者中,體內(nèi)血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致腫瘤壞死因子、血小板源生長(zhǎng)因子的大量生成,誘導(dǎo)其變成單核細(xì)胞、纖維細(xì)胞,形成ⅠL-6,而ⅠL-6又能夠增加纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的表達(dá),最終引發(fā)周?chē)茏枇Φ纳?導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生[8]。長(zhǎng)期的高血壓會(huì)使腎小球處于高濾過(guò)和高灌注狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致系膜細(xì)胞增生硬化，局部腎小球及腎小管缺血、功能受損，導(dǎo)致腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及腎小球纖維化等病理學(xué)改變[9]。

泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核細(xì)胞清除蛋白質(zhì)主要通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、抗原呈遞、細(xì)胞增殖與分化以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過(guò)程。免疫疫蛋白酶體中β1i、β2i和β5i是催化亞基，其中β5i亞基由275個(gè)氨基酸組成，具有糜蛋白酶樣活性，β5i作為免疫蛋白酶體的核心亞基，具有糜蛋白酶樣活性，可以調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及提呈內(nèi)源性抗原或病毒介導(dǎo)的MHC-Ⅰ限制性抗原[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)了一種β5i亞基的特異性抑制劑，其活性成分為PR-957(ONX 0914)[11]。研究表明PR-957可抑制小鼠自身免疫和炎癥相關(guān)性疾病[12]。我們既往研究證明在DOCA鹽敏感型高血壓小鼠心肌中β5i蛋白水平明顯上調(diào)，而β5i抑制劑PR-957處理后可明顯改善DOCA鹽誘導(dǎo)的腎臟功能增高及心肌肥厚[4]。但是，PR-957在DOCA鹽敏感高血壓性腎臟纖維化的作用尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫蛋白酶體抑制劑PR-957顯著降低DOCA/鹽引起腎小管-間質(zhì)纖維化的發(fā)展和炎癥因子( ⅠL-1β、ⅠL-6 和TNF-α) 的表達(dá)，提示PR957對(duì)DOCA-高鹽高血壓小鼠的腎臟損傷可以起保護(hù)作用。免疫蛋白酶體β5i 亞基可作為治療高血壓性腎臟損傷的一個(gè)潛在新靶點(diǎn)。但其深入的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。