朱志偉 鄭培明 王榮

脂多糖（lipopolysacharide，LPS）可加重腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)并可促進(jìn)疾病發(fā)生及發(fā)展［1］。研究表明miR-204-3p 在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中表達(dá)下調(diào)，miR-204-3p 過表達(dá)可減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［2］。生物信息學(xué)分析顯示細(xì)胞色素P450 家族2 亞家族E 成員1（Cytochrome P450 2E1，CYP2E1）可能是miR-204-3p 的靶基因，研究表明CYP2E1 在酒精性胰腺炎中表達(dá)上調(diào)并可參與該疾病發(fā)生過程［3］。但miR-204-3p 是否可通過靶向調(diào)控CYP2E1 的表達(dá)而影響腎小管上皮細(xì)胞損傷尚未可知。因此，本研究通過LPS 誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞，探討miR-204-3p 對腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響，分析其對CYP2E1 的靶向調(diào)控作用，為進(jìn)一步揭示腎小管上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 購自上?；鶢栴D生物；LPS 購自北京百奧萊博科技有限公司；Lipofectamine2000 購自美國Thermo Fisher 公司；miR-204-3p mimics 及陰性對照miR-NC、si-CYP2E1、si-NC、anti-miR-204-3p 購自廣州銳博生物；pcDNA3.1 購自上?？吕咨铮籘rizol 試劑購自美國Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購自大連寶生物；IL-6、TNF-α 檢測試劑盒購自南京建成生物；細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國Sigma；兔抗人CYP2E1 抗體購自上海生工生物；兔抗人Bcl-2、Bax 抗體購自美國CST 公司；二抗購自美國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

腎小管上皮細(xì)胞（2×105個(gè)/mL）接種于6 孔板（150 μL/孔），加入含有10 μg/mL LPS 的培養(yǎng)液處理24 h［4］，記作LPS組。同時(shí)將未經(jīng)處理的細(xì)胞作為Con組。分別將miR-NC、miR-204-3p mimics、si-NC、si-CYP2E1、miR-204-3p mimics 與pcDNA、miR-204-3p mimics 與pcDNA-CYP2E1 轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞48 h，加入含有10 μg/mL LPS的培養(yǎng)液處理24 h，分別記作LPS+miR-NC 組、LPS+miR-204-3p 組、LPS+si-NC 組、LPS+si-CYP2E1 組、LPS+miR-204-3p+pcDNA 組、LPS+miR-204-3p+pcDNA-CYP2E1 組。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細(xì)胞中miR-204-3p、CYP2E1 mRNA 的表達(dá)水平

收集各組腎小管上皮細(xì)胞，采用Trizol 法提取細(xì)胞中的總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 合成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，根據(jù)試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-204-3p、CYP2E1 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測IL-6、TNF-α的水平

收集各組腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA 法檢測IL-6、TNF-α 的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

收集各組腎小管上皮細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌，加入500 μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，依次分別加入5 μL Annexin V-FITC 與5 μL PI，充分混勻，室溫避光孵育20 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-204-3p 的靶基因

構(gòu)建野生型載體WT-CYP2E1、突變型載體MUT-CYP2E1，分別將miR-NC、miR-204-3p mimics 與WT-CYP2E1、MUT-CYP2E1 共轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后加入雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒相關(guān)試劑，按說明書操作檢測熒光素酶活性。

1.2.6 Western blot 檢測CYP2E1、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)

RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，取30 μg 變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗稀釋液（1∶1 000），孵育二抗稀釋液（1∶2 000），滴加ECL，曝光，顯影，應(yīng)用ImageJ 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)；計(jì)量資料以（±s）表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-204-3p 和CYP2E1 在脂多糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

LPS 組細(xì)胞中miR-204-3p 的表達(dá)水平降低，CYP2E1 mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著升高，與Con 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 CYP2E1 蛋白表達(dá)Figure 1 The expression of CYP2E1 protein

表1 miR-204-3p 和CYP2E1 在脂多糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n=9）Table 1 The expression of miR-204-3p and CYP2E1 in renal tubular epithelial cells stimulated by lipopolysaccharide（±s，n=9）

表1 miR-204-3p 和CYP2E1 在脂多糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n=9）Table 1 The expression of miR-204-3p and CYP2E1 in renal tubular epithelial cells stimulated by lipopolysaccharide（±s，n=9）

分組Con LPS t 值P 值miR-204-3p 1.01±0.09 0.58±0.05 12.530 0.000 CYP2E1 mRNA 0.99±0.08 3.01±0.29 20.144 0.000 CYP2E1 蛋白0.42±0.04 0.83±0.07 15.256 0.000

2.2 miR-204-3p 過表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和凋亡的影響

與Con 組比較，LPS 組IL-6、TNF-α 水平、凋亡率及Bax 蛋白水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS+miR-NC 組比較，LPS+miR-204-3p 組IL-6、TNF-α 水平、凋亡率及Bax 蛋白水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 miR-204-3p 過表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 The effect of miR-204-3p overexpression on the apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide

2.3 抑制CYP2E1 表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和凋亡的影響

與LPS+si-NC 組比較，LPS+si-CYP2E1組IL-6、TNF-α水平、凋亡率及Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、表3。

圖3 抑制CYP2E1 表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 The effect of inhibiting CYP2E1 expression on the apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide

表2 miR-204-3p 過表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和凋亡的影響（±s，n=9）Table 2 The effect of miR-204-3p overexpression on the expression of inflammatory factors and apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide（±s，n=9）

表2 miR-204-3p 過表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和凋亡的影響（±s，n=9）Table 2 The effect of miR-204-3p overexpression on the expression of inflammatory factors and apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide（±s，n=9）

分組Con LPS LPS+miR-NC LPS+miR-204-3p F 值P 值miR-204-3p 1.00±0.05 0.57±0.05 0.55±0.06 0.81±0.07 122.022 0.000 IL-6（ng/mL）3.45±0.36 15.24±1.53 16.22±1.74 6.21±0.62 251.116 0.000 TNF-α（ng/mL）1.74±0.17 8.36±0.83 8.57±0.81 3.55±0.36 283.598 0.000凋亡率（%）6.58±0.66 27.32±2.71 29.65±2.84 11.02±1.13 280.387 0.000 Bcl-2 蛋白0.67±0.06 0.25±0.03 0.23±0.03 0.59±0.05 236.203 0.000 Bax 蛋白0.30±0.03 0.78±0.07 0.79±0.06 0.38±0.03 234.495 0.000

表3 抑制CYP2E1 表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和凋亡的影響（±s，n=9）Table 3 The effect of inhibiting CYP2E1 expression on the expression of inflammatory factors and apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide（±s，n=9）

表3 抑制CYP2E1 表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和凋亡的影響（±s，n=9）Table 3 The effect of inhibiting CYP2E1 expression on the expression of inflammatory factors and apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide（±s，n=9）

分組Con LPS LPS+si-NC LPS+si-CYP2E1 F 值P 值CYP2E1 蛋白0.41±0.04 0.85±0.07 0.87±0.08 0.50±0.05 131.123 0.000 IL-6（ng/mL）3.65±0.35 16.34±1.63 17.02±1.69 8.32±0.81 267.156 0.000 TNF-α（ng/mL）1.98±0.19 8.92±0.88 9.01±0.89 5.69±0.54 210.345 0.000凋亡率（%）7.02±0.71 28.41±2.84 28.69±2.88 13.58±1.37 227.065 0.000 Bcl-2 蛋白0.66±0.06 0.24±0.03 0.22±0.03 0.53±0.05 215.506 0.000 Bax 蛋白0.31±0.03 0.76±0.07 0.77±0.07 0.42±0.04 162.049 0.000

2.4 miR-204-3p 靶向調(diào)控CYP2E1 的表達(dá)

TargetScan 預(yù)測顯示CYP2E1 的3'UTR 中含有與miR-204-3p 互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖4。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-204-3p過表達(dá)可降低WTCYP2E1 的熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。miR-204-3p 負(fù)向調(diào)控CYP2E1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5、表5。

圖4 CYP2E1 的3'UTR 中含有與miR-204-3p 互補(bǔ)的核苷酸序列Figure 4 The 3'UTR of CYP2E1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-204-3p

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果（±s，n=9）Table 4 Dual luciferase report test results（±s，n=9）

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果（±s，n=9）Table 4 Dual luciferase report test results（±s，n=9）

分組miR-NC miR-204-3p t 值P 值WT-CYP2E1 1.03±0.07 0.61±0.06 13.667 0.000 MUT-CYP2E1 1.05±0.06 1.02±0.08 0.900 0.381

3 討論

圖5 CYP2E1 蛋白表達(dá)Figure 5 The expression of CYP2E1 protein

表5 miR-204-3p 調(diào)控CYP2E1 蛋白的表達(dá)（±s，n=9）Table 5 miR-204-3p regulated the expression of CYP2E1 protein（±s，n=9）

表5 miR-204-3p 調(diào)控CYP2E1 蛋白的表達(dá)（±s，n=9）Table 5 miR-204-3p regulated the expression of CYP2E1 protein（±s，n=9）

分組miR-NC miR-204-3p anti-miR-NC anti-miR-204-3p F 值P 值CYP2E1 蛋白0.43±0.04 0.21±0.02 0.42±0.04 0.86±0.07 315.388 0.000

miR-204-3p 通過調(diào)節(jié)乳酸脫氫酶介導(dǎo)的糖酵解而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖［5］。研究表明miR-204-3p 通過靶向Braykinin B2 受體而減輕高糖誘導(dǎo)的MPC5 足細(xì)胞凋亡［6］。相關(guān)報(bào)道指出miR-204-3p可調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為［7］。本研究結(jié)果顯示LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中miR-204-3p 的表達(dá)量降低。IL-6、TNF-α 水平升高可促進(jìn)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生從而促使疾病進(jìn)展［8］。本研究結(jié)果顯示LPS 處理后IL-6、TNF-α 水平升高，而miR-204-3p 過表達(dá)可顯著減低IL-6、TNF-α水平，提示miR-204-3p 過表達(dá)可減輕LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷。本研究結(jié)果顯示LPS 處理后腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高，而miR-204-3p過表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，提示miR-204-3p 過表達(dá)可抑制LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。

CYP2E1 在高糖誘導(dǎo)的小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中表達(dá)增加，槲皮素通過抑制CYP2E1表達(dá)減輕高糖誘導(dǎo)的小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［9］。CYP2E1 在酒精性肝病大鼠模型的肝組織中表達(dá)增強(qiáng)，抑制CYP2E1 可減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［10］。本研究結(jié)果顯示LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中CYP2E1 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步分析顯示抑制CYP2E1 表達(dá)后IL-6、TNF-α 水平降低，細(xì)胞凋亡率降低，提示抑制CYP2E1 表達(dá)可抑制LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡。本研究證實(shí)miR-204-3p 能夠靶向結(jié)合CYP2E1，CYP2E1 過表達(dá)可減弱miR-204-3p 過表達(dá)對LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及凋亡的作用。

綜上所述，LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中miR-204-3p 表達(dá)下調(diào)，CYP2E1 表達(dá)上調(diào)，miR-204-3p過表達(dá)可抑制LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控CYP2E1 的表達(dá)有關(guān)，可為急性腎損傷等腎臟疾病的診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。