趙 今，吳澤鈺，龔 怡，王 琛

（1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院/附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，烏魯木齊830054）

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是牙菌斑與宿主免疫反應(yīng)共同相互作用后，發(fā)生的一類炎癥性疾病。這種炎癥可以破壞牙周支持組織，進(jìn)而形成牙周袋和牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，慢性牙周炎的治療有時(shí)會(huì)使用抗生素作為輔助用藥，以緩解機(jī)械治療不能到達(dá)的炎癥部位[2]。但是抗生素的一些副作用減少了使用頻率，而中醫(yī)以其良好的治療作用在許多國家引起了廣泛的關(guān)注和接受。牛膝為莧科牛膝屬植物（Achyranthis Bidentatae Radix）之干燥根，牛膝的用藥歷史悠久，藥源廣泛，具有很大的開發(fā)潛力[3]。在很多治療骨質(zhì)疏松的方劑中，牛膝是一味主要用藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，牛膝具有抗炎、抗衰老及增強(qiáng)免疫力等作用[4]。天然藥物中通常含有許多活性成分，一般可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思想有很大相似之處。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究牛膝提取物在治療CP的活性成分，及分析其潛在分子機(jī)制和藥理活性。

1 材料與方法

1.1篩選牛膝中活性成分及預(yù)測靶點(diǎn) 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(tái)（TCMSP）篩選并整理牛膝化學(xué)成分及靶點(diǎn)。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件，篩選出牛膝中的活性成分及作用靶點(diǎn)。

1.2 篩選CP靶點(diǎn) 以詞"chronic periodontitis，periodontitis"為關(guān)鍵詞，在Genecards、DrugBank、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索，可獲得CP靶點(diǎn)。與牛膝所篩選出的作用靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析，得到牛膝治療CP的作用靶點(diǎn)。

1.3構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 將牛膝的化學(xué)成分及所篩選出的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，進(jìn)行“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，Network Analyzer計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，度值（degree）、中心度（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）和拓?fù)湎禂?shù)（topological coefficient）。

1.4構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 所得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，設(shè)置“homo sapiens”屬性，置信度得分＞0.4，利用Network Analyzer分析拓?fù)鋵傩裕瑯?gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5基因本體（gene ontology,GO）和京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析 利用Cluster Profiler軟件包對(duì)獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析及KEGG富集分析繪圖，篩選生物途徑和分子功能篩選錯(cuò)誤率(false discovery rate，F(xiàn)DR)＜0.001，P＜0.001，篩選有顯著性差異的生物過程和信號(hào)通路。

1.6通路-CP靶點(diǎn)-牛膝活性成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將通路、靶點(diǎn)和成分導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中，利用的“Merge”功能合并，構(gòu)建“通路-靶點(diǎn)-成分”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1牛膝活性成分篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及藥代動(dòng)力學(xué)（ADME）參數(shù)篩選出牛膝的活性成分20個(gè)，見表1。

表1 牛膝主要活性成分及參數(shù)

2.2 牛膝與CP的共同靶點(diǎn) 檢索得到CP相關(guān)的疾病靶點(diǎn)4 543個(gè)，去除重復(fù)后得2 132個(gè)。檢索得到牛膝作用靶點(diǎn)826個(gè)，去除重復(fù)后得457個(gè)。韋恩分析二者交集靶點(diǎn)（圖1），獲得牛膝與CP共有靶點(diǎn)183個(gè)，其中包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素-10（Interleukin 10，IL-10）、白介素-6（Interleukin 6，IL-6）等，見表2。

2.3“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析顯示，化合物的平均度數(shù)為5.9，其中度數(shù)較大（度數(shù)＞10）的化合物為槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、山奈酚、黃芩苷、豆甾醇、β谷甾醇、小檗堿、刺苷A、黃連堿、表小檗堿、巴馬汀。牛膝中各成分作用于多種靶點(diǎn)，多條線互相交織。根據(jù)獲得的交集靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)到牛膝中18個(gè)主要成分，共含248個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 738條邊緣，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)中的度值從大到小依次進(jìn)行排列，見圖2、表3。

圖1牛膝與CP的Venn圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將183個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。根據(jù)度值大小篩選出前30位的靶點(diǎn)（圖3B），其中前10位分別為是AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、EGFR、PTGS2、CASP3、JUN、MAPK1（表4）。

表2牛膝治療CP的成分作用靶點(diǎn)信息

圖2 牛膝-成分-靶點(diǎn)-牙周炎網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

表3 牛膝活性成分的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析

圖3牛膝化學(xué)成分治療CP靶點(diǎn)-蛋白相互作用

2.5 GO和KEGG富集分析 對(duì)上述183個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，設(shè)置閾值P＜0.01，生物過程(biological process，BP)相關(guān)條目880個(gè)，涉及抑菌活性、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)等方面；分子功能(molecular function，MF)相關(guān)條目49個(gè)，涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面；細(xì)胞成分(cellular component，CC)相關(guān)條目23個(gè)，涉及膜筏、膜區(qū)等方面。BP、MF、CC功能分別GO富集分析出的前5條條目信息見表5。MF、CC、CC功能GO富集分析結(jié)果見圖4～6。KEGG分析得到265條信號(hào)通路，根據(jù)P值篩選出101條通路。其中信號(hào)通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等；疾病通路有癌癥通路、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、乙肝、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等通路。見圖7、表5。

表4牛膝治療CP核心蛋白互作的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

表5牛膝治療CP的潛在靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果（各前5條）

圖4 MF功能GO富集分析結(jié)果

圖5 CC功能GO富集分析結(jié)果

圖6 BP功能GO富集分析結(jié)果

圖7牛膝治療CP的潛在靶點(diǎn)的KEGG富集分析

表5牛膝治療CP的潛在靶點(diǎn)KEGG富集分析（前10條）

2.6 牛膝活性成分-核心CP靶點(diǎn)-代謝通路網(wǎng)絡(luò)“通路-靶點(diǎn)-牛膝成分”網(wǎng)絡(luò)可見45個(gè)信號(hào)通路、183個(gè)核心靶點(diǎn)、18個(gè)藥物成分間關(guān)系密切，見圖8。提示，牛膝中的多種活性成分可能通過調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路以調(diào)節(jié)慢性牙周炎的炎癥、成骨等過程。

圖8 牛膝活性成分-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

CP是口腔疾病中常見疾病，臨床表現(xiàn)常以牙齦腫脹，牙槽骨吸收最終牙齒松動(dòng)脫落為主要發(fā)展過程，這已成為人類失牙的主要原因之一。有效的牙周治療仍是一個(gè)長期的難題，牙周治療的目標(biāo)以消除牙周病的感染和炎癥過程為主[5]。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可通過藥物配伍控制菌斑、殺滅微生物、促組織再生、消炎等治療牙周炎[6]。

牛膝是我國的一味傳統(tǒng)中藥，歷史非常悠久，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因?yàn)樾螤钏婆Ｏザ妹?。本研究得出牛膝在治療CP時(shí)含有18種有效成分。其中黃芩苷是牛膝中的主要成分之一，黃芩苷治療牙周疾病的過程中，在抑菌和抗炎中發(fā)揮了很好的效果[7]。牛膝中的蛻皮甾酮經(jīng)過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖以及分化，牛膝甾酮能夠顯著上調(diào)成骨分化相關(guān)標(biāo)志物，最終促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期分化和晚期礦化能力[8]。近年來的研究表明，牛膝中的成分不僅能抑制小鼠耳廓腫脹，而且也能抑制毛細(xì)血管的通透性增加[9]，抵抗炎癥反應(yīng)。其抗炎機(jī)制可能與抑制活化巨噬細(xì)胞炎性因子TNF-α，IL1β的釋放有關(guān)[10]。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析，與牛膝治療CP有關(guān)的前10位靶點(diǎn)分別是AKT1、IL6、TNF、VEGFA等。其中AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被PI3K激活并募集到質(zhì)膜上，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和凋亡方面起著重要作用[11]。而TNF-α能夠增加破骨細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)量、誘導(dǎo)骨髓中巨噬細(xì)胞的破骨分化及破骨細(xì)胞成熟從而促進(jìn)骨吸收[12]，IL-6不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞活化并產(chǎn)生破骨細(xì)胞分化因子，進(jìn)一步加速破骨細(xì)胞形成[13]，而且還參與牙周炎的炎癥過程，其濃度的變化與牙周炎的炎癥程度相關(guān)，并抑制牙周膜的再生[14]。VEGFA是血管發(fā)育中最重要的生長因子，它促進(jìn)骨祖細(xì)胞分化，還可以促進(jìn)骨相關(guān)細(xì)胞因子如膠原、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和堿性磷酸酶(ALP)的分泌[15]。

本研究對(duì)牛膝治療CP所富集到的183個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路分析，涉及到抑菌活性、創(chuàng)傷愈合、細(xì)胞遷移的正調(diào)控等952個(gè)GO條目。已有研究證明槲皮素對(duì)牙齦假單胞菌的各種毒力因子均有很好的抑制作用[16]。牙周組織的再生依賴于有效和平穩(wěn)的傷口愈合過程，而創(chuàng)傷愈合過程在很大程度上取決于血管生成[17]。研究發(fā)現(xiàn)牛膝提取物主要通過促進(jìn)細(xì)胞遷移來促進(jìn)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和體內(nèi)斑馬魚的血管生成，也可加速成纖維細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[18]。這體現(xiàn)了牛膝治療CP多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。KEGG富集分析得到與牛膝治療CP相關(guān)的信號(hào)通路有101條，其中涉及了糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等。AGEs通過RAGE、MAPK和NF-κB途徑增加IL-6和ICAM-1的表達(dá)，可能加重牙周病發(fā)病的進(jìn)程[19]。此外，Lin等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-17刺激健康人牙周膜細(xì)胞后，p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平均明顯增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)證明，牛膝提取物中的黃芩苷可降低ERK、p38、JNK等蛋白的磷酸化，進(jìn)一步抑制炎癥因子的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[21]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，闡述了牛膝中的主要成分、潛在治療CP的靶點(diǎn)、作用途徑及可能的機(jī)制。探究了牛膝治療CP具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，為今后牛膝在治療CP中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。