陳會蓮 薛蕓 孫杰 張晟皓 王慧 陳北冬 齊若梅

腦血管病是全球高致死、高致殘和高復(fù)發(fā)的疾病，動脈粥樣硬化是腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)[1]。研究結(jié)果顯示，氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生與進展[2]；刺激血小板活化，促進血栓形成。目前，通過抑制血小板功能途徑預(yù)防腦血管疾病已成為重要的防治策略。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫系統(tǒng)的受體家族，能對病原相關(guān)分子模式和危險相關(guān)分子模式做出免疫應(yīng)答[3]，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生與進展[4-5]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是細(xì)胞外含有鋅離子的蛋白水解酶，可通過蛋白質(zhì)水解使血管細(xì)胞外基質(zhì)膠原成分降解，與不穩(wěn)定型斑塊相關(guān)聯(lián)[6-7]。MMPs大多由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，但血小板活化是否產(chǎn)生MMPs尚不清楚。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一種植物多酚，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等作用[8-10]。該研究探討了RSV對ox-LDL刺激血小板TLR2和MMP1表達的影響及相關(guān)的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料血液源自健康獻血者，每位捐贈者均簽署書面知情同意書。實驗操作符合《赫爾辛基宣言》有關(guān)原則。本研究經(jīng)北京老年醫(yī)學(xué)研究院倫理委員會批準(zhǔn)通過(No.201606)。

1.2 主要試劑RSV購自美國Sigma-Aldrich公司(Lot# SLBS1063V)，抗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)抗體、抗TLR2抗體、抗MMP1抗體購自Abcam公司，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、兔抗山羊二抗購自北京中杉金橋公司，環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)ELISA試劑盒購自Abcam公司，丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和一氧化氮(nitric oxide，NO)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，紅色線粒體超氧化物熒光探針MitiSOXTM購自Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1制備洗滌血小板：采集健康獻血者血液，置枸櫞酸抗凝真空采血管。以200 g離心10 min，分離上清，獲到富血小板血漿。加入TYRODE Buffer(含138 mmol/L NaCl、3.3 mmol/L NaH2PO4、2.9 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L Glucose、20 mmol/L HEPES，pH 7.2)和 9∶1的ACD，添加2 mmol/L EDTA，混勻，以200 g離心10 min。棄上清，懸浮細(xì)胞。再次離心，獲得洗滌血小板。

1.3.2制備ox-LDL：收集血清，采用梯度超速離心法分離低密度脂蛋白。使用5 μmol/L硫酸銅氧化，37℃，10 h，加入1 mmol/L EDTA終止反應(yīng)。隨后采用PBS(pH 7.3)4℃透析24 h，4℃儲存。

1.3.3分組及處理：將純化的血小板分為對照組、ox-LDL處理組及RSV 1、10、100 μmol/L干預(yù)組。對照組和ox-LDL處理組分別用配置RSV溶液的溶劑孵育10 min，干預(yù)組分別用1、10和100 μmol/L RSV孵育10 min。然后，除對照組外各組分別加入ox-LDL(0.1 mg/mL)刺激血小板10 min，終止反應(yīng)。根據(jù)作者既往研究結(jié)果顯示ox-LDL處理10 min可誘導(dǎo)血小板炎癥蛋白表達[11]，該研究采用ox-LDL處理10 min后檢測血小板MDA、SOD、cGMP和NO水平。

1.3.4MDA、SOD、cGMP和NO水平檢測：按照試劑盒說明書步驟檢測血小板MDA、SOD、cGMP和NO水平。每個實驗重復(fù)4次。

1.3.5Western blot方法檢測TLR2、MMP1和NOX4蛋白表達：對照組和ox-LDL處理組分別用配制RSV溶液的溶劑孵育10 min，干預(yù)組分別用1、10和100 μmol/L RSV孵育血小板10 min，然后，除對照組外各組分別加入ox-LDL(0.1 mg/mL)刺激血小板10 min，終止反應(yīng)。檢測TLR2表達時，增加了LPS(5 μg/mL)刺激血小板的實驗。將血小板分為對照組、LPS處理組及RSV 1、10、100 μmol/L干預(yù)組。對照組和LPS處理組分別用配制RSV溶液的溶劑孵育10 min，干預(yù)組分別用1、10和100 μmol/L RSV孵育10 min。除對照組外各組分別加入LPS(5 μg/mL)刺激10 min，終止反應(yīng)。每個實驗重復(fù)4次。將樣本進行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉2 h。使用TLR2、MMP1和NOX4特異性抗體孵育4℃過夜。TBS-T洗3次。二抗(1∶10000)孵育2 h。使用ECL發(fā)光液發(fā)光，用凝膠成像儀成像，采用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度與內(nèi)參條帶灰度比值表示蛋白相對表達水平。

1.3.6血小板線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)測定：將20 μg/mL鼠尾膠原蛋白包被載玻片過夜。以RSV(100 μmol/L)孵育血小板10 min，加入0.1 mg/mL ox-LDL 10 min，以350 g離心10 min，用含MitiSOXTM(1∶2000)的Tyrode’s/HEPES緩沖液重懸(1×106)血小板，取血小板重懸液加于載玻片上反應(yīng)30 min。吸除多余的血小板懸液，用緩沖液洗滌3次。在共聚焦顯微鏡下觀察熒光強度，60倍鏡下成像，對各組熒光強度進行定性分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗；兩均數(shù)比較用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血小板TLR2表達比較與對照組比較，ox-LDL處理組血小板TLR2蛋白表達明顯增加(t=0.021，P<0.01)；ox-LDL處理組及不同濃度RSV干預(yù)組間比較TLR2蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.240，P<0.01)，與ox-LDL處理組比較，RSV 100 μmol/L干預(yù)組TLR2表達降低(P<0.05)。與對照組比較，LPS處理組血小板TLR2表達明顯增加(t=0.004，P<0.01)；LPS處理組及不同濃度RSV干預(yù)組間比較TLR2蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.279，P<0.05)，與LPS處理組比較，RSV 100 μmol/L干預(yù)組血小板TLR2表達降低(P<0.05)。結(jié)果見圖1。

注：ox-LDL：氧化低密度脂蛋白，RSV：白藜蘆醇，圖2～6同；LPS：脂多糖；TLR2：Toll樣受體2；A：ox-LDL刺激實驗；B：LPS刺激實驗；aP<0.05，bP<0.01

2.2 各組血小板MMP1表達比較與對照組比較，ox-LDL處理組血小板MMP1表達增加(t=0.009，P<0.01)。ox-LDL處理組及不同濃度RSV干預(yù)組間血小板MMP1表達比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=6.160，P<0.01)，與ox-LDL處理組比較，RSV 100 μmol/L干預(yù)組MMP1表達降低(P<0.01)。結(jié)果見圖2。

注：MMP1：基質(zhì)金屬蛋白酶1；aP<0.01

2.3 各組血小板NOX4表達與對照組比較，ox-LDL處理組血小板NOX4表達增加(t=0.002，P<0.01)。ox-LDL處理組及不同濃度RSV干預(yù)組間血小板NOX4表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.886，P<0.01)，與ox-LDL處理組比較，RSV 100 μmol/L干預(yù)組NOX4表達降低(P<0.01)。結(jié)果見圖3。

注：NOX4：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4；aP<0.01；bP<0.05

2.4 各組血小板線粒體ROS水平與對照組比較，經(jīng)ox-LDL處理可增加血小板線粒體ROS水平，而RSV(100 μmol/L)可降低其水平。結(jié)果見圖4。

2.5 各組血小板MDA和SOD水平與對照組比較，ox-LDL處理組血小板MDA水平升高(t=0.001，P<0.01)。ox-LDL處理組及不同濃度RSV干預(yù)組間血小板MDA水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.654，P<0.01)，與ox-LDL處理組比較，RSV1、10、100 μmol/L干預(yù)組血小板MDA水平降低(P<0.05或P<0.01)。與對照組比較，ox-LDL處理組血小板SOD活力降低(t=0.040，P<0.05)。ox-LDL處理組及不同濃度RSV干預(yù)組間血小板SOD活性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.276，P<0.05)，與ox-LDL處理組比較，RSV 100 μmol/L干預(yù)組SOD活性升高(P<0.05)。結(jié)果見圖5。

注：MDA：丙二醛，SOD：超氧化物歧化酶；aP<0.01；bP<0.05

2.6 各組血小板NO/cGMP水平與對照組比較，ox-LDL處理組血小板NO水平降低(t=0.004，P<0.01)；ox-LDL組及不同濃度RSV干預(yù)組間血小板NO水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=29.343，P<0.01)，與ox-LDL組比較，RSV 1、10、100 μmol/L干預(yù)組血小板NO水平增加(均P<0.01)。與對照組比較，ox-LDL處理組cGMP水平降低(t=0.002，P<0.01)；ox-LDL組及不同濃度RSV干預(yù)組間血小板cGMP水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.043，P<0.01)，與ox-LDL處理組比較，RSV 10、100 μmol/L干預(yù)組cGMP水平升高(均P<0.01)。結(jié)果見圖6。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種血管的慢性炎癥性疾病，是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)[12]。血小板作為炎癥細(xì)胞通過分泌各種炎癥蛋白、P-選擇素、血小板因子4和激活后調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTENS)等細(xì)胞因子募集炎癥細(xì)胞到內(nèi)皮細(xì)胞損傷部位，促進血管炎癥，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生與進展[13]。血小板表達多種TLRs受體，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR8和TLR9[3，14]。既往研究表明，TLR2可介導(dǎo)血小板活化，參與血小板黏附、釋放和聚集[15]。ox-LDL是動脈粥樣硬化發(fā)生的危險因素[16]，血循環(huán)中ox-LDL增加不僅損傷內(nèi)皮細(xì)胞，還能刺激血小板活化。MMPs具有消化血管基質(zhì)成分的作用，病理條件下MMPs水平增加會導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)紊亂。因此，減少血管炎癥以及降低MMPs水平對于延緩動脈粥樣硬化病變進展具有重要意義。

近年來作者團隊研究顯示，RSV能夠抑制血小板TLR4表達，并能夠增加血小板沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)表達和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)磷酸化[11]。然而，RSV對ox-LDL刺激血小板活化MMPs的影響尚不清楚。該研究結(jié)果顯示，ox-LDL可刺激血小板TLR2和MMP1表達，RSV能抑制這一炎癥反應(yīng)。NO/cGMP為細(xì)胞內(nèi)第二信使，具有抑制血小板功能的作用。該研究結(jié)果顯示RSV能夠逆轉(zhuǎn)活化血小板NO/cGMP降低的變化，提示RSV不僅能抑制ox-LDL刺激活化血小板炎癥蛋白表達，同時還能增加細(xì)胞內(nèi)保護性分子水平。此外，該研究亦發(fā)現(xiàn)RSV可抑制ox-LDL刺激血小板NOX4表達以及ROS產(chǎn)生，進一步證實RSV抑制血小板功能的分子機制與減少線粒體氧化損傷相關(guān)。

綜上所述，本研究顯示，RSV能夠通過降低血小板TLR2、MMP1和 NOX4的表達，減少血小板ROS和MDA的產(chǎn)生，并增加NO/cGMP含量，提示RSV具有抑制ox-LDL刺激血小板活化的作用，其分子機制與抑制氧化損傷和增加細(xì)胞內(nèi)保護性分子NO/cGMP水平有關(guān)，表明RSV通過多個分子靶點抑制血小板功能，可能成為抑制動脈粥樣硬化血管炎癥干預(yù)的潛在藥物。