范 穎， 李 清， 周麗華， 賀 健， 張 熠， 寧玲忠， 蘇建明， 雷紅宇*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省株洲市農(nóng)村農(nóng)業(yè)局，湖南株洲412000）

目前， 食品和糧食安全已成為全球公共衛(wèi)生健康所關(guān)注的主要問題之一。 霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物， 既可在糧食作物田間生長時產(chǎn)生，也可出現(xiàn)在糧食作物的生產(chǎn)、加工、運輸和儲存等過程中。 伏馬毒素（FB）是主要由層生鐮刀菌、 串珠鐮刀菌等鐮刀屬霉菌產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，于1988 年在串珠鐮刀菌液中被首次分離， 主要污染水稻、 玉米等農(nóng)作物及其衍生食品。 伏馬毒素為不同的多氫醇和丙三羧酸構(gòu)成的雙酯類化合物，性質(zhì)非常穩(wěn)定。 到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了28 種結(jié)構(gòu)類似物，可分為A、B、C、P 四類，其中毒性最強、 在自然界含量最多的是伏馬毒素B1（FB1）。FB1的污染范圍廣泛且較為嚴重，杜妮等（2019）在2018 年對河南、河北、江西、湖南等12省份的800 份飼用玉米、豆粕、麩皮和飼料等樣品進行了檢測，發(fā)現(xiàn)FB1的陽性檢出率為66.5%，其中玉米樣品中含量高達74.69%。 FB1具有多種毒性作用，可引起人類食管癌、豬肺水腫、馬腦白質(zhì)軟化病、大鼠肝癌等疾?。–ome 等，2019；黎曉雯等，2019；蔣艷成等，2016）。本試驗以小鼠為模型，通過觀察血液學(xué)指標、 細胞凋亡變化等來研究FB1對小鼠的毒性作用， 以期為FB1中毒的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 40 只健康昆明小鼠，每只（20±2）g， 購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，雌雄各半。

1.1.2 主要試劑 Tunel 細胞凋亡檢測試劑盒，購自博士德生物科技有限公司；總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽固醇（T-CHO）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、尿素（Urea）、肌酐（CRE）等檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；RNA 提取試劑盒，購自北京天恩澤基因科技有限公司；PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqTM， 購自TaKaRa公司；甲醛，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 切片機（型號：RM2235），購于德國Leica 公司；電熱恒溫干燥箱（型號：202）、恒溫培養(yǎng)箱（型號：DH-420AB），購于北京中興偉業(yè)儀器有限公司；超純水儀（型號：AFXI-0501-P），購于美國艾科蒲公司； 熒光顯微鏡（型號：Nikon Eclipse C1），購于日本尼康公司；自動高壓滅菌鍋（型號：YXQ-LS-1851），購于博訊實業(yè)有限公司；電熱恒溫水浴鍋（型號：DK-98IIA），購于天津市泰斯特儀器有限公司； 冷凍高速離心機 （型號：CF16RXII），購于日本Hitachi Koki 公司；酶標儀（型號：1510），購于美國Thermo 公司；核酸蛋白儀（型號：RS232C）、冷凍離心機（型號：5417R），購于Eppendorf 公司；電泳儀（型號：9162），購于北京六一儀器廠； 熒光定量PCR 儀 （型號：CFX ConnectTM），購于美國BIO-RAD 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 飼料的制備 在馬鈴薯培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)高產(chǎn)伏馬毒素的串珠鐮刀菌， 然后加入玉米碎粒中培養(yǎng)1 周， 烘干后作為玉米原料用于小鼠飼料的配制，經(jīng)檢測飼料中FB1的含量為36.82 mg/kg。

1.2.2 試驗動物分組與處理 將購買的40 只健康昆明小鼠隨機分成對照組與染毒組，雌雄各半。對照組飼喂正常飼料，染毒組飼喂含F(xiàn)B1的飼料，連續(xù)飼喂45 d。 試驗期間保證適宜的通風(fēng)條件、充足的光照、水源和飼料，小鼠自由采食、飲水。

1.2.3 臨床癥狀和體重變化觀察 在試驗進行的45 d 內(nèi)，每日觀察、記錄小鼠的精神狀態(tài)、進食情況、被毛和糞便等，稱量并記錄小鼠的體重。

1.2.4 樣品采集 連續(xù)染毒45 d 后， 對小鼠停止喂食12 h，然后放血處死，部分血液收集到含有抗凝劑的滅菌離心管內(nèi)用于血常規(guī)檢測，部分收集到普通滅菌離心管內(nèi)，于4 ℃靜置至血清分離，然后離心，收集上層血清用于血液生化指標檢測。 剖檢小鼠，取肝臟、腎臟和脾臟等臟器，部分于福爾馬林溶液中固定，部分置于低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 小鼠血常規(guī)和血液生化指標的測定 取新鮮采集的抗凝全血， 使用動物血常規(guī)測定儀檢測白細胞數(shù)量（WBC）、淋巴細胞數(shù)量（LY）、血紅蛋白含量（HGB）和紅細胞壓積（HCT）等相關(guān)血常規(guī)指標。

取小鼠血清， 根據(jù)各個試劑盒內(nèi)說明書方法檢測總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽固醇（TCHO）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、尿素（Urea）和肌酐（CRE）等指標。

1.2.6 小鼠臟體比的測定 小鼠剖殺后，將肝臟、腎臟和脾臟等器官稱重，并計算各臟器的臟體比。

臟體比/%=臟器重量/體重×100。

1.2.7 Tunel 法對小鼠脾臟凋亡的測定 將福爾馬林固定的脾臟組織按常規(guī)石蠟切片方法制作切片，取切片脫蠟入水，然后滴加新鮮稀釋的Proteinase K（與0.01 moL TBS 按1：200 的比例稀釋）于玻片上， 消化5 ～10 min。 0.01 moL TBS 洗3次，每次2 min，按每張玻片取TdT 和DIG-d-UTP各1 μL，與18 μL 標記緩沖液混勻后加在切片上，于37 ℃濕盒中標記2 h。 0.01 moL TBS 洗3 次，每次2 min，隨后每片玻片加50 μL 封閉液，室溫放置30 min，甩掉封閉液。 用抗體稀釋液1：100 稀釋生物素化抗地高辛抗體， 混勻后滴加50 μL 于玻片上，37 ℃濕盒中反應(yīng)30 min，0.01 moL TBS 洗3 次，每次2 min。 然后用抗體稀釋液1：100 稀釋SABC， 混勻后每片玻片滴加50 μL，37 ℃濕盒中反應(yīng)30 min，0.01 moL TBS 洗4 次， 每次5 min。待切片干燥后，中性樹脂封片，在熒光顯微鏡下觀察脾臟中細胞凋亡情況并拍照， 細胞核呈棕黃色即為凋亡細胞。

1.2.8 小鼠器官內(nèi)凋亡相關(guān)基因表達的測定 取小鼠的肝臟、脾臟和腎臟組織約100 mg，研磨搗碎，使用RNA 提取試劑盒提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后以cDNA為模板，采用SYBR 熒光染料進行qPCR 反應(yīng)。 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)，65 ℃延伸。 結(jié)果用2-△△ct法進行計算，其中△Ct = Ct目的基因-CtGAPDH的平均值，△△Ct=△Ct-△Ct對照組的平均值， 以β-actin 為內(nèi)參基因?qū)谢虻谋磉_歸一化， 從而得出靶基因的相對mRNA 表達水平。各基因的引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS 17.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理與分析，兩組間比較為t 檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析， 結(jié)果以“平均值±標準誤” 表示，P ＞0.05 表示差異不顯著，P ＜0.05 表示差異顯著，P ＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 FB1染毒后對小鼠臨床癥狀的影響 試驗組小鼠染毒FB1連續(xù)7 d 后，出現(xiàn)食欲下降、精神萎靡、被毛光澤下降；30 d 后發(fā)現(xiàn)小鼠排便異常，肛門周圍存在污濁物，精神萎靡、行為遲緩、體格瘦??；試驗進行至45 d 時，各只小鼠體型明顯瘦小、被毛雜亂，且體重顯著降低（P ＜0.01）（圖1）。

圖1 FB1 染毒后小鼠的體重變化結(jié)果

2.2 FB1染毒后對小鼠血常規(guī)指標的影響 由表2 可知，血液中淋巴細胞百分比和淋巴細胞數(shù)量均顯著下降（P ＜0.05），分別下降約4.48 個百分點和2.98×109，血紅蛋白含量顯著減少約8.37 g/L（P ＜0.05），其他指標無明顯變化（P ＞0.05）。

表2 FB1 對小鼠血常規(guī)指標的影響

2.3 FB1染毒后對小鼠血液生化指標的影響 由表3 可知，小鼠染毒FB1后，血液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的含量顯著上升約51.93 U/L （P ＜0.05），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的含量顯著上升約38.94 U/L（P ＜0.05）， 尿素的含量顯著上升約4.14 mmol/L（P ＜0.05）； 而總蛋白和白蛋白的含量顯著下降（P ＜0.05）， 分別下降約11.32 g/L 和5.99 g/L，肌酐和總膽固醇含量則無明顯變化（P ＞0.05）。

表3 FB1 對小鼠血液生化指標的影響

2.4 FB1染毒后對小鼠臟體比的影響 如表4 所示，與對照組相比，染毒組中脾臟的臟體比明顯下降了0.1%（P ＜0.05）， 肝臟和腎臟的臟體比無顯著變化（P ＞0.05）。

表4 FB1 對小鼠臟體比的影響%

2.5 FB1染毒后對小鼠脾臟凋亡的影響 由Tunel 法檢測小鼠脾臟細胞凋亡的結(jié)果可知，對照組中有極少量棕黃色染色的凋亡淋巴細胞， 而染毒組中可見大量棕黃色細胞， 表明染毒伏馬毒素B1后脾臟淋巴細胞凋亡顯著增多。

2.6 FB1對小鼠器官內(nèi)凋亡相關(guān)基因mRNA 表達的影響 FB1染毒后小鼠肝臟、 脾臟和腎臟中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Fas 和P53 基因mRNA 表達量的結(jié)果見圖2。 由圖中可見肝臟和脾臟中Bcl-2 的mRNA 水平顯著降低 （P ＜0.05），Bax、Caspase 3、Caspase 9、P53 的mRNA 水平都顯著上升（P ＜0.05），且Fas 的表達量在脾臟中也顯著升高（P ＜0.05）。腎臟中僅Bax 的mRNA水平顯著升高（P ＜0.05），Caspase 3、Caspase 9 和Bcl-2 的mRNA 水平也受到影響， 但差異不顯著（P ＞0.05）。

3 討論

霉菌感染和霉菌毒素的危害是目前種植業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中不可避免的影響因素， 伏馬毒素B1（FB1）是一種常見的霉菌毒素，被FB1污染的農(nóng)作物、 糧食及其衍生食物會通過食物鏈的傳遞進一步危害人類和畜禽的健康， 或降低動物的生長性能而對養(yǎng)殖業(yè)帶來重大損失。

圖2 FB1 對小鼠器官內(nèi)凋亡相關(guān)基因mRNA 表達的影響

血液通過循環(huán)與各個器官和組織進行物質(zhì)交換，并起到調(diào)節(jié)和防御功能。 當機體受到外界不良刺激時， 血液內(nèi)的物質(zhì)成分和血細胞的理化性質(zhì)會發(fā)生改變， 誘發(fā)機體出現(xiàn)不同程度的生理和病理變化，進而引發(fā)組織和器官損傷（楊帆等，2020）， 因此血液學(xué)指標與機體的器官功能、 營養(yǎng)代謝及健康狀況密切相關(guān)。 本研究對FB1染毒后的小鼠進行血常規(guī)檢查，結(jié)果顯示血液中淋巴細胞數(shù)量、 淋巴細胞百分比及血紅蛋白含量（HGB）顯著降低（P ＜0.05）。 脾臟是機體免疫系統(tǒng)中的一個重要器官， 與免疫功能密切相關(guān)， 本研究檢測小鼠的各臟器指數(shù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B1染毒后脾體比顯著下降，而Tunel 法檢測小鼠脾臟淋巴細胞凋亡數(shù)在染毒后FB1后明顯增多。Abbe`s 等（2016）用100 μg/kg 的FB1連 續(xù) 灌 胃Balb/c 小鼠2 周后也發(fā)現(xiàn)脾體比顯著降低，與本試驗的結(jié)果一致。這些結(jié)果提示FB1對小鼠脾臟的損傷明顯，可能導(dǎo)致機體免疫力下降。

霉菌毒素對動物的靶器官主要為肝臟和腎臟（錢智勇等，2018）， 常導(dǎo)致肝臟和腎臟損傷，臨床上相關(guān)指標發(fā)生變化。 血清中總蛋白（TP）和白蛋白（ALB）反映了機體蛋白質(zhì)吸收與代謝的程度，ALB 是TP 的組成成分，在肝臟實質(zhì)細胞中合成， 在維持血漿膠體滲透壓和運輸營養(yǎng)物質(zhì)等過程中發(fā)揮作用。 血液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）是反映肝臟功能的標志性酶，尿素（Urea）和肌酐（CRE）是腎臟功能的主要指標（王利軍等，2017）。本研究檢測了FB1染毒后小鼠血液生化指標的變化，發(fā)現(xiàn)AST、ALT、Urea 的含量都顯著升高 （P ＜0.05），TP 和ALB 的含量顯著降低（P ＜0.05），CRE 和T-CHO的含量也受到影響，這表明FB1染毒后導(dǎo)致小鼠肝臟和腎臟功能下降，可能造成損傷。 郭文博等（2015）研究中用不同濃度FB1對BALB/c 小鼠進行灌胃處理，發(fā)現(xiàn)小鼠的采食量和體重呈降低趨勢；當FB1作用濃度達到1.5 mg/kg BW FB1以上時，小鼠的脾臟、肺臟、腎臟顯著發(fā)生腫脹，肝臟出現(xiàn)明顯損傷，血液中性粒細胞、血紅蛋白和血小板的數(shù)量隨FB1劑量的增加而升高，且谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、總膽紅素和肌酐的濃度均顯著高于對照組。Ezdini（2020）等用100 μg/kg BW 的FB1處理BALB/c 小鼠后，血液中平均血紅蛋白濃度、平均血紅蛋白含量和紅細胞壓積等發(fā)生顯著變化，表明血液系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)受到破壞， 且FB1處理后AST、ALT、 堿性磷酸酶 （ALP） 和乳酸脫氫酶（LDH） 等抗氧化酶活性顯著升高，TP、ALB 等指標顯著下降。 這表明FB1染毒會影響小鼠血液學(xué)指標，可能對器官造成損傷。

細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，受內(nèi)在遺傳機制的控制自動結(jié)束生命的過程，分為線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，線粒體途徑是主要的凋亡途徑（韓笑等，2020）。促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2 屬于Bcl-2 家族，其與腫瘤抑制因子P53 相互作用，在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。 Bcl-2 家族中的Bad可介導(dǎo)P53 轉(zhuǎn)移到線粒體上與Bcl-2 或Bcl-xl結(jié)合，使Bax 游離并活化（Toesca 等，2016）。 Fas屬于TNF 家族，參與死亡受體途徑，這兩種途徑激活后都要通過活化Caspase 家族從而誘發(fā)細胞凋亡。 Zhang 等（2018）用10 μmol/L FB1染毒豬腎上皮細胞 （PK-15）24 h 后發(fā)現(xiàn)細胞凋亡增多，并誘導(dǎo)細胞氧化損傷。 為進一步探討FB1致小鼠損傷的機制，本試驗對小鼠肝臟、脾臟和腎臟中凋亡相關(guān)基因的表達水平進行了檢測。 結(jié)果顯示Bax 在肝、脾、腎中的表達均顯著上升，Bcl-2、Caspase 3、Caspase 9 和P53 在肝和脾中顯著升高， 而Fas 的表達只在脾中顯著升高。Bhandari 等（2002）用2.25 mg/kg 的FB1連續(xù)皮下注射BALB/c 小鼠5 d 后， 肝臟中Caspase 3、Bax、Bcl-2 和Bad 的表達顯著增加。 這說明線粒體途徑或死亡受體途徑可能參與了FB1誘導(dǎo)小鼠脾臟發(fā)生凋亡的過程。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明， 伏馬毒素B1會影響小鼠生長狀態(tài)和血液學(xué)指標，可能對器官造成損傷，并且還可能通過線粒體途徑或死亡受體途徑誘導(dǎo)小鼠脾臟凋亡，進而導(dǎo)致脾臟損傷，機體免疫力下降。