陳華軒，羅 波，王 林，張 淵，劉 毅，范潤金

(四川省南充市中心醫(yī)院/川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，四川南充 637000)

腦卒中是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，其中缺血性腦卒中約占80%[1]，它因發(fā)病率和致殘率“雙高”的特點而備受重視。缺血性腦卒中急性期患者主要通過組織纖溶酶原激活物靜脈溶栓治療，但血管再通可導(dǎo)致神經(jīng)細胞延遲死亡，從而引起腦缺血/再灌注損傷[2]。既往研究證實細胞凋亡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血腦屏障破壞等是缺血性腦卒中導(dǎo)致腦損傷的主要發(fā)病機制[3]，進一步研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路是一種調(diào)控腦缺血/再灌注損傷的重要途徑[4]，但現(xiàn)階段仍未明確腦缺血/再灌注損傷被Notch信號通路調(diào)控的具體機制。N-[N-(3，5-雙氟酚內(nèi)氨酰)]-S-苯氨基乙酸t(yī)-丁基酯{N-[N-(3，5-difluorohenacetyl-L-alanyl)]-S-phenyl glycine t-butyl ester，DAPT}作為常見的γ-分泌酶抑制劑，其通過阻斷酶切過程來抑制Notch信號通路的信號傳導(dǎo)，有助于減輕腦缺血/再灌注損傷。本研究通過DAPT預(yù)處理及建立局灶性小鼠腦缺血/再灌注模型，觀察動物模型神經(jīng)功能缺損、神經(jīng)細胞凋亡、腦梗死體積、炎癥指標(biāo)、星形膠質(zhì)細胞活化指標(biāo)、Notch信號通路激活指標(biāo)的變化，旨在探討DAPT預(yù)處理對腦缺血/再灌注損傷小鼠的神經(jīng)保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物及實驗材料

SPF級8周齡雄性C57BL/6小鼠75只，體質(zhì)量(28±2)g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-0004；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium,chloride,TTC)染液購于北京雷根生物技術(shù)有限公司；Hes1和Hes5 抗體購于美國Abcam公司；DAPT和Notch1抗體購于美國CST公司；白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR(RT-PCR)引物和PCR試劑盒、TRIzol試劑購自北京賽因坦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1分組與建模

小鼠分為假手術(shù)組、大腦中動脈缺血/再灌注組(模型組)、DAPT預(yù)處理+大腦中動脈缺血/再灌注組(DAPT預(yù)處理組)，每組25只。DAPT預(yù)處理組小鼠造模前連續(xù)7 d每天腹腔注射1次DAPT(20 mg/kg)，而模型組和假手術(shù)組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。DAPT預(yù)處理組與模型組用線栓法閉塞右側(cè)大腦中動脈缺血2 h，再灌注24 h，而假手術(shù)組僅采用相同的手術(shù)方法，沒有插入線栓。采用線栓法閉塞右側(cè)大腦中動脈，建立局灶性小鼠腦缺血/再灌注模型具體過程如下：通過腹腔內(nèi)注射體積分數(shù)10% 的水合氯醛麻醉小鼠(2.5 mL/kg)，從頸部正中切開皮膚后將右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈仔細分離，然后在離頸總動脈分叉處5 mm處做一個小切口，將0.3 mm線栓從頸總動脈緩慢插入頸內(nèi)動脈至大腦中動脈，缺血2 h后輕柔拉出線栓，使血流恢復(fù)正常。

1.2.2Longa生物學(xué)評分評價神經(jīng)功能缺損

在小鼠腦缺血2 h及再灌注24 h后采用Longa生物學(xué)評分評估其神經(jīng)功能缺損狀況，具體評分細則如下。小鼠活動完全正常、沒有任何神經(jīng)功能缺損癥狀，記為0分；將小鼠提尾懸空后其出現(xiàn)左側(cè)前肢屈曲、肘關(guān)節(jié)伸直、肩部內(nèi)收為輕度神經(jīng)功能缺損，記為1分；小鼠爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈并且側(cè)推時左右推動的阻力不等為中度神經(jīng)功能缺損，記為2分；左側(cè)肢體肌力明顯減退導(dǎo)致其不能承受體重而向左側(cè)傾倒為重度神經(jīng)功能缺損，記為3分；呈筒樣滾動或無自主活動，甚至意識障礙為嚴重神經(jīng)功能缺損，記為4分。其中1～3分視為合格模型，排除0分及4分模型。

1.2.3TUNEL染色檢測神經(jīng)元細胞凋亡

采用TUNEL 染色法對小鼠凋亡神經(jīng)元細胞進行計數(shù)，遵照TUNEL試劑盒說明書的操作步驟檢測各組小鼠缺血半側(cè)區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡。正常神經(jīng)元細胞顯示為藍色，而凋亡神經(jīng)元細胞核在顯微鏡下則顯示為不均一的紫色，即為TUNEL陽性。顯微鏡下計數(shù)視野內(nèi)凋亡神經(jīng)元細胞。

1.2.4TTC染色測定小鼠腦梗死體積

小鼠迅速斷頭并取出腦組織，于-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍20 min后沿冠狀位切成2 mm厚的薄片，然后在避光、室溫下將腦薄片放于2% TTC溶液中浸泡30 min，后于4%多聚甲酸溶液中固定24 h，拍片后運用Image-Pro Plus7.0圖像處理軟件測定腦梗死體積。

1.2.5RT-PCR測定小鼠腦組織的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3) mRNA相對表達水平

取小鼠缺血側(cè)大腦組織，稱量腦組織并加入TRIzol試劑后用勻漿器勻漿，完成低溫離心、氯仿抽取、75%乙醇洗滌和焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，然后進行總RNA濃度測量、RNA定量、稀釋、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；加入GFAP引物(上游引物5′-TGG AAA TGA CAG TGA AGC ACC TC-3′，下游引物5′-TCG TTC ATG CAC TCG CTG AAG-3′)、STAT3引物(上游引物5′-CCA TTG GGC CAT CCT GTT TCT-3′，下游引物5′-AGA AAC AGG ATG GCC CAA TGG-3′)后使用CFX Connect Real Time PCR儀進行PCR反應(yīng)，檢測各組GFAP mRNA和STAT3 mRNA的相對表達水平。

1.2.6Western blot檢測小鼠腦組織Notch1、Hes1、Hes5蛋白的相對表達水平

將小鼠在冰上迅速斷頭后取出缺血側(cè)大腦組織，稱重后加入裂解液勻漿，取經(jīng)離心處理的上清液備用；用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，取等量蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；用脫脂奶粉(50 g/L)在室溫下封閉2 h，然后分別加入Hes1、Hes5、Notch1(1∶1 000)及β-actin(1∶2 000)一抗，并在4 ℃恒溫孵育過夜；加入二抗(1∶2 000)后在室溫下孵育1 h，然后洗膜、避光條件下滴加ECL顯影，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析。以標(biāo)準(zhǔn)參照條帶為基準(zhǔn)，采用Syngene Bio Imaging檢測系統(tǒng)分析目的條帶灰度值，計算各目的蛋白的相對表達水平。

1.2.7ELISA檢測小鼠腦組織IL-1β、TNF-α的水平

取小鼠缺血側(cè)腦組織加入裂解液后用勻漿器勻漿，完成離心處理后取上清液備用，分別按照IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒說明書方法，由有檢測資質(zhì)的實驗員進行測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 小鼠神經(jīng)功能缺損情況

Longa生物學(xué)評分結(jié)果顯示，假手術(shù)組Longa生物學(xué)評分為0分(無神經(jīng)功能缺損癥狀)；模型組Longa生物學(xué)評分為(2.12±0.39)分，神經(jīng)功能缺損較對照組加重，而DAPT預(yù)處理組Longa生物學(xué)評分[(1.29±0.25)分]顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

a：P<0.01，與模型組比較；b：P<0.05，與假手術(shù)組比較。

2.2 小鼠神經(jīng)元細胞凋亡及腦梗死體積比較

TUNEL染色評估神經(jīng)元細胞凋亡結(jié)果顯示，DAPT預(yù)處理組、模型組、假手術(shù)組的神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)分別為(33.60±2.41)個、(75.00±2.74)個、(4.00±1.58)個，3組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。TTC染色檢測的結(jié)果顯示DAPT預(yù)處理組、模型組、假手術(shù)組的腦梗死體積分別為(19.87±1.18)mm3、(42.37±0.85)mm3、0 mm3，3組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.3 小鼠腦組織GFAP和STAT3 mRNA相對表達水平比較

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，模型組GFAP和STAT3 mRNA相對表達水平較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，而DAPT預(yù)處理組GFAP mRNA和STAT3 mRNA相對表達水平較模型組顯著降低(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。

圖2 TUNEL染色顯示各組神經(jīng)元凋亡情況(X400)

圖3 TTC染色顯示各組腦梗死情況

a：P<0.01，與模型組比較；b：P<0.05，與假手術(shù)組比較。

2.4 Hes1、Hes5及Notch1蛋白相對表達水平比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組Hes1、Hes5及Notch1蛋白相對表達水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，DAPT預(yù)處理組Hes1、Hes5及Notch1蛋白相對表達水平較模型組顯著降低(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5。

2.5 IL-1β、TNF-α結(jié)果比較

ELISA檢測結(jié)果顯示，模型組IL-1β、TNF-α較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，DAPT預(yù)處理組IL-1β、TNF-α表達水平較模型組顯著降低(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖6。

A:Western blot；B：Western blot分析圖。a：P<0.01，與模型組比較；b：P<0.05，與假手術(shù)組比較。

a：P<0.01，與模型組比較；b：P<0.05，與假手術(shù)組比較。

3 討 論

缺血性腦卒中導(dǎo)致的再灌注損傷危害極大，而Notch信號通路已被發(fā)現(xiàn)在腦缺血/再灌注損傷中起著重要的調(diào)節(jié)作用[5]。神經(jīng)祖細胞增殖、遷移、分化和凋亡被具有高度保守性的Notch信號通路精確調(diào)控，Notch信號通路在細胞生長和生理功能等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。研究顯示，鄰近細胞的Notch受體與配體相互作用而產(chǎn)生Notch信號，通過3次裂解Notch受體蛋白形成胞內(nèi)段，Hes1、Hes5等下游靶基因被CSL結(jié)合蛋白與進入細胞核的胞內(nèi)段結(jié)合形成的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體激活，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[7]。

DAPT是最常用的γ-分泌酶抑制劑，它作用于Notch受體S3蛋白水解酶切割位點，阻止胞內(nèi)段的形成，抑制Notch信號通路下游效應(yīng)分子Hes1、Hes5表達，進而使神經(jīng)祖細胞向神經(jīng)元細胞分化[8]。研究顯示，腦缺血/再灌注損傷激活Notch信號通路會使神經(jīng)元細胞凋亡加劇，而腦缺血/再灌注的細胞凋亡效應(yīng)在使用Notch信號阻斷劑后顯著減輕[9]。本研究通過DAPT預(yù)處理抑制腦缺血/再灌注小鼠的Notch信號通路，探討其對腦缺血/再灌注損傷小鼠的作用。結(jié)果顯示，模型組出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損，TUNEL染色示大量凋亡神經(jīng)元細胞，TTC染色示右側(cè)大腦半球大面積梗死，并且Notch1、Hes1和Hes5 蛋白表達水平明顯升高。然而DAPT預(yù)處理組神經(jīng)功能缺損較模型組明顯減輕，凋亡神經(jīng)元細胞及腦梗死面積顯著減少，而且Notch1、Hes1及Hes5 蛋白表達水平顯著降低，由此說明Notch信號通路被DAPT抑制，DAPT預(yù)處理能減少腦缺血/再灌注損傷小鼠的神經(jīng)元凋亡細胞與促進神經(jīng)功能恢復(fù)，這與王晗等[10]的研究結(jié)果一致。

STAT3是一種具備信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄功能并廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的DNA結(jié)合蛋白，對腦缺血/再灌注損傷導(dǎo)致的炎性反應(yīng)有一定調(diào)控作用，激活的STAT3進入細胞核內(nèi)啟動其下游基因轉(zhuǎn)錄，進而促進炎性因子IL-1β、TNF-α等表達[11]。WU 等[12]報道，抑制STAT3信號通路使炎性因子的表達水平降低，可減輕腦缺血/再灌注損傷的炎性反應(yīng)。DING 等[13]靶向抑制STAT3信號通路減輕了腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)炎性損傷。本研究結(jié)果顯示，模型組IL-1β、TNF-α及STAT3 mRNA表達水平較假手術(shù)組顯著增加，表明腦缺血/再灌注使抗炎能力減弱，神經(jīng)損傷加重，但DAPT預(yù)處理組IL-1β、TNF-α及STAT3 mRNA表達水平較模型組明顯降低。由此可見，DAPT預(yù)處理抑制Notch信號通路可以通過降低STAT3的活化，提高腦缺血/再灌注損傷小鼠的抗炎能力，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

GFAP是星形膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物之一，它特異地存在星形膠質(zhì)細胞中并反映星形膠質(zhì)細胞的活性。過度活化的星形膠質(zhì)細胞會在病灶周圍形成膠質(zhì)瘢痕，同時分泌硫酸軟骨素蛋白多糖，它們均會抑制軸突再生，阻礙神經(jīng)功能恢復(fù)[14]。WANG 等[15]研究表明，抑制星形膠質(zhì)細胞過度活化和膠質(zhì)瘢痕形成可通過抑制GFAP基因表達來實現(xiàn)，從而改善腦缺血后神經(jīng)功能。DZAMBA 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，使用反義GFAP mRNA技術(shù)抑制星形膠質(zhì)細胞過度活化能減少星形膠質(zhì)細胞肥大與促進神經(jīng)元軸突生長。本研究結(jié)果顯示，模型組的GFAP mRNA表達水平顯著高于假手術(shù)組，然而，DAPT預(yù)處理組GFAP mRNA表達水平較模型組明顯降低，表明腦缺血/再灌注后星形膠質(zhì)細胞過度活化被DAPT預(yù)處理抑制，提示抑制Notch信號通路可能通過抑制GFAP過度表達來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，DAPT預(yù)處理能明顯減輕腦缺血/再灌注小鼠的神經(jīng)功能缺損，減少神經(jīng)元凋亡、腦梗死體積及減輕炎性反應(yīng)，對腦缺血/再灌注損傷有神經(jīng)保護作用，其可能機制為DAPT預(yù)處理通過抑制Notch信號通路來減弱STAT3活化與抑制GFAP過度表達。