李永翔，蔣海嬌，郭建華

（齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

我國黃酒歷史悠久，是世界三大古酒之一，它主要以谷物（稻米、小米、玉米）為原料，利用曲藥作為糖化發(fā)酵劑進行釀造，曲中所含微生物種類繁多，既有細菌，也有霉菌、酵母等[1]。因此，研究玉米黃酒在發(fā)酵過程中微生物群落結構及組成，能夠幫助我們更好地揭示在發(fā)酵過程中菌群的結構變化，為今后分析微生物對于黃酒酒質的影響打下基礎。

此前，有關微生物群落及其多樣性的研究主要基于傳統(tǒng)的微生物分離及純培養(yǎng)技術、熒光定量 PCR技術[2]、變性梯度凝膠電泳技術（DGGE）[3]、末端限制性片段長度多態(tài)性分析技術（TRFLP）[4]等。但上述研究方法往往難以得到確切的微生物種類及其絕對含量。高通量測序技術作為新一代測序方法，在微生態(tài)領域有著廣泛應用前景。聶志強等采用高通量測序技術對食醋釀造過程中的原核微生物群落結構進行了分析，發(fā)現(xiàn)醋酸發(fā)酵過程中醋酸菌和乳酸菌是優(yōu)勢細菌，而隨著發(fā)酵的進行，醋酸菌的豐度不斷增加，乳酸菌卻在不斷減少[5]。趙景龍等用MiSeq 高通量測序平臺對清香型白酒發(fā)酵酒醅不同位點的細菌進行了分析，發(fā)現(xiàn)在不同位置酒醅中優(yōu)勢細菌相差較大，中心部位主要是Lactobacillaceae、Streptococcaceae 等厭氧或兼性厭氧細菌，靠近邊沿處則以好氧細菌居多[6]。本研究采用高通量測序技術對玉米黃酒發(fā)酵各個階段的群落結構及其變化規(guī)律進行研究，旨在為探索玉米黃酒釀制過程提供一定的理論依據(jù)，為后續(xù)研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料

玉米采用齊齊哈爾本地種植品種，酒曲（購自廣西某地）。

1.2 方法

將干玉米脫胚破碎成直徑為2～5 mm 的顆粒，然后在55～60 ℃的水浴下，用質量分數(shù)為0.15%～0.20%亞硫酸溶液浸泡50 h。蒸熟晾涼后接入曲種，前3 天在30 ℃下糖化發(fā)酵，之后投水在16 ℃條件下發(fā)酵，在發(fā)酵的第5 天進行密封發(fā)酵。分別在發(fā)酵0, 3, 6, 12, 18, 24 d 取樣（下文樣本標作0, 1, 2, 3, 4, 5），所有樣品-80 ℃保存，后送往上海凌恩生物科技有限公司，對樣品341F-806R 和ITS1F-ITS2R 區(qū)進行高通量測序，測序引物為341F，806R 以及ITS1F，ITS2F。引物序列為5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’，5’- GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’和5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。利用Illumina（MiSeq）平臺對獲得的序列進行歸并分類。

根據(jù)測序結果進行多樣性分析及組件樣本差異，根據(jù)每個樣本在各個分類水平下具體組成，分析不同發(fā)酵時期樣本的群落組成及其動態(tài)變化，并找出可能對玉米黃酒品質有重要影響的菌群。

2 結果與討論

2.1 OTU 聚類統(tǒng)計

通過高通量測序技術，在黃酒發(fā)酵各個階段的稀疏曲線如圖1 所示。

從圖1 可以看出，隨著測序量的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，這反映了目前測序數(shù)量已滿足了樣本的多樣性。

圖1 黃酒發(fā)酵過程中細菌與真菌稀疏曲線

2.2 菌群多樣性分析

使用Mothur 軟件以97%相似度進行歸并分析，利用得出的OTU 數(shù)進行多樣性分析。從表1 中可以看出細菌Chao 值先下降，中期上升后再下降的趨勢，顯示出在發(fā)酵最初期時物種豐度最高，原因在于傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵工藝中，原料水并不需要滅菌操作，而且在前期攪拌過程中，器具及外界空氣也帶入了一部分微生物進入，隨著發(fā)酵時間的持續(xù)，發(fā)酵產(chǎn)生的CO2使得微生物處于缺氧的環(huán)境，同時某些微生物代謝產(chǎn)生有機酸使pH 逐漸下降，酒精度逐漸上升，在這種不適宜微生物生長的條件下，會抑制絕大部分微生物的生長繁殖。Shannon 值的下降和Simpson 值的逐漸升高反映了群落的多樣性越來越低。

從真菌中可以看出Chao1 值先上升后下降，說明了在發(fā)酵中期物種最為豐富。Shannon 值先上升后下降，Simpson 值先下降后上升，說明了中期真菌多樣性較高，而在發(fā)酵末期菌群結構越發(fā)簡單。原因在于發(fā)酵末期微生態(tài)環(huán)境變化使得真菌的繁殖受到了抑制，降低了物種的多樣性。

表1 玉米黃酒發(fā)酵不同階段的細菌（a）和真菌（b）Alpha 多樣性

2.3 菌群結構及動態(tài)變化

2.3.1 門，屬分類水平下的細菌群落結構

通過RDP Classifier 軟件對OTU 物種比對注釋顯示，玉米黃酒發(fā)酵過程中的細菌主要屬于6 個菌門，26 個屬。

在門分類水平下，變形菌門（Proteobacteria）細菌在發(fā)酵的全過程下始終屬于絕對優(yōu)勢菌群，其豐度占到整個菌群的66.49%～86.91%。雖然擬桿菌門（Bacteroidetes）是第二大菌門，但其平均占比僅有9.96%～13.03%。此外放線菌門（Actinobacteria）占比只有1.99%～10.83%，排在第三。這表明，在玉米黃酒發(fā)酵全過程中，細菌的群落結構高度不一。

在屬分類水平下，細菌群落結構均一性同樣很低。本次檢測得到239 個菌屬，但其中只有前26 個屬的相對豐度大于整個菌群的1%。隨著發(fā)酵的進行，貪噬菌屬（Variovorax）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、產(chǎn)氫菌屬（Hydrobacter）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）一直處于相對優(yōu)勢占比。而其他菌屬在菌群占比均比較低，且在整體發(fā)酵過程中相對豐度變化不明顯，說明發(fā)酵環(huán)境抑制了其生長，大部分的微生物不能在高酸度，高乙醇濃度及厭氧環(huán)境下生存而逐漸消亡。

圖2 細菌在門水平（a）和屬水平（b）群落組成豐度分布圖

2.3.2 門，屬分類水平下的真菌群落結構

對黃酒發(fā)酵液中的真菌群落進行鑒定分析，結果顯示其真菌主要屬于2 個菌門，4 個屬。在門分類水平下，子囊菌門（Ascomycota）占據(jù)絕對優(yōu)勢，其相對豐度占比為97.43%～99.49%。擔子菌門（Basidiomycota）占比0.35%～2.61%。這也與欒同青[9]的研究結果相似[7]。

在屬分類水平下，曲霉屬（Aspergillus）占比為18.09%～77.70%，塞伯林德納氏酵母屬（Cyberlindnera）占比為21.73%～75.35%，Kwoniella 屬占比為0.23%～2.05%，威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）占比為0.01%～3.56%。曲霉菌屬真菌在黃酒發(fā)酵過程中起到液化、糖化、蛋白質分解的效果，同時形成還原糖、氨基酸、多肽等[8]。酵母菌屬在黃酒生產(chǎn)中產(chǎn)酯、產(chǎn)醇、產(chǎn)有機酸等風味物質，主要起生香作用[9]。

真菌的菌群結構簡單是由多方面因素造成的，如酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的酒精會對自身和其他真菌有毒害作用，曲霉屬代謝產(chǎn)生的有機酸也會使真菌的生長環(huán)境發(fā)生改變，使其不宜生長繁殖。

圖3 真菌在門水平（a）和屬水平（b）群落組成豐度分布圖

3 結論

本次研究表明在發(fā)酵過程中細菌種類要比真菌豐富。對微生物相對豐度進行統(tǒng)計表明，變形菌門是黃酒發(fā)酵液中絕對優(yōu)勢細菌，還有其它菌屬如擬桿菌門和放線菌門。而子囊菌門則是優(yōu)勢真菌，曲霉屬和酵母屬也被檢測到。在屬水平下貪噬菌屬、慢生根瘤菌屬、產(chǎn)氫菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比細菌屬較高，而曲霉屬、塞伯林德納氏酵母在真菌屬中占比較高。微生物直接影響著黃酒的品質和風格，因此針對微生物的研究將永不止步。