張軍，尹珺 伊，王巖，田秋豐，劉秋瑾，何佳琦，黃宇翔，王麗坤，史同瑞，翟瑩

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾161005；2.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾161006）

植物表皮毛普遍存在于陸生植物的體表，這種特化的結(jié)構(gòu)可以在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮保護(hù)作用，例如減少植物熱量和水分的散失，保護(hù)植物免受昆蟲和病原體的侵害等[1-2]。無表皮毛增強子結(jié)合蛋白（Glabrous-enhancer binding protein，GeBP）是植物中特有的一類非經(jīng)典亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子蛋白，它們在表皮毛的發(fā)生過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這種作用是通過調(diào)控GL1（GLABROUS1）基因（擬南芥中控制表皮毛發(fā)生的基因之一）的表達(dá)來實現(xiàn)的[3]。目前，已經(jīng)在擬南芥、水稻、番茄和毛竹中分別鑒定了16[3]、15[4]、10[5]和16[6]個GeBP 基因家族成員。擬南芥AtGeBP 并不參與細(xì)胞的增殖過程，而是通過調(diào)控擬南芥體內(nèi)赤霉素和細(xì)胞分裂素來控制表皮毛細(xì)胞的伸長[5,7]。毛竹中12 個PeGeBP 的表達(dá)量在有表皮毛的組織中高于無表皮毛的組織，表明這些基因參與了表皮毛形成的調(diào)控。

大豆是重要的油料作物，其表皮毛的發(fā)生具有重要的研究價值。大豆基因組測序的完成以及植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB 的構(gòu)建[8]，為大豆轉(zhuǎn)錄因子家族的獲取及功能研究提供了便利。但到目前為止，有關(guān)大豆GeBP 轉(zhuǎn)錄因子家族基因的功能研究尚未開展。本研究利用生物信息學(xué)方法對大豆中的9 個GmGeBP基因進(jìn)行了預(yù)測分析，為后續(xù)GmGeBP 基因的功能研究提供參考和理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料

從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/index.php）中下載大豆GmGeBP 轉(zhuǎn)錄因子家族的基因及蛋白質(zhì)序列。

1.2 生物信息學(xué)分析

通過DNAMAN 軟件將下載的GmGeBP 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，剔除重復(fù)序列。使用在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）對GmGeBP 蛋白的分子量和等電點進(jìn)行預(yù)測；使用在線網(wǎng)站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1）對GmGeBP 蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域及位置進(jìn)行預(yù)測；使用在線網(wǎng)站NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對GmGeBP 蛋白的磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測；使用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）對GmGeBP 蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測；使用在線網(wǎng)站MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）對GmGeBP 蛋白的保守基序進(jìn)行搜索。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

從PlantTFDB 數(shù)據(jù)庫中獲取擬南芥GeBP 蛋白序列。利用MEGA5 軟件中的鄰接法（NJ）法構(gòu)建大豆和擬南芥GeBP 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Boot-strap 重復(fù)次數(shù)默認(rèn)1 000，其他均為默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 GmGeBP 家族基因的獲取及序列分析

在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB 中獲得10 個大豆候選GmGeBP 基因序列。通過蛋白質(zhì)序列比對，剔除1 個重復(fù)基因序列，將剩余的9 個GmGeBP 基因依次命名為GmGeBP1-9。進(jìn)一步對GmGeBP 基因及蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果如表1 所示，9 個GmGeBP 基因分別分布在大豆的7 條染色體上（3、5、10、13、15、19 和20 號染色體），其中10 號和20 號染色體上分別含有2 個GmGeBP 基因。它們所編碼的肽鏈長度在353～448 個氨基酸之間，蛋白序列長度差異較大，因此它們的蛋白分子量差異也較大，范圍在39.65～49.24 之間。除GmGeBP2 蛋白的等電點為9.08，其他GmGeBP 蛋白的等電點范圍處在4.65～5.48 之間，偏酸性類型。

表1 9 個大豆GmGeBP 基因及蛋白序列的鑒定及特性

2.2 GmGeBP 蛋白保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點及亞細(xì)胞定位預(yù)測分析

保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析結(jié)果如圖1 所示，9 個GmGeBP 蛋白序列中均含有1 個功能未知的DUF573 基序。因為DUF573 基序是GeBP 轉(zhuǎn)錄因子的中央結(jié)合DNA 結(jié)構(gòu)域[5]，進(jìn)一步證明所鑒定的9 個蛋白均為GeBP家族成員。此外，GmGeBP1、3、5、6、7、9 含有多個低重復(fù)序列區(qū)和1 個螺旋區(qū)域，GmGeBP2、4、8 僅含有多個低重復(fù)序列區(qū)，GmGeBP7 還含有1 個SCOP 結(jié)構(gòu)域。9 個GmGeBP 基因序列中DUF573 基序所處位置存在一定差異，且除了DUF573 基序較為保守外，其他序列部分相似度較低。此外，9 個GmGeBP 基因所編碼的肽鏈長度差異也較大，等電點也各不相同。這些都可能與GmGeBP 基因功能差異相關(guān)。

磷酸化位點預(yù)測結(jié)果顯示（表1），除GmGeBP6 蛋白僅含有絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）磷酸化位點外，其他8 個GmGeBP 蛋白均含有不同數(shù)量的Ser、Thr 和酪氨酸（Tyr）磷酸化位點，且Ser 數(shù)量﹥Thr數(shù)量﹥Tyr 數(shù)量。根據(jù)GmGeBP 蛋白中大量磷酸化位點的存在，推測它們可以借助磷酸化及去磷酸化作用調(diào)節(jié)GmGeBP 蛋白與DNA 順式作用元件的結(jié)合[9]。

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示（表1），9 個GmGeBP 蛋白定位于細(xì)胞核中的概率均大于89%，且它們均含有1～3 個明顯的核定位信號。這與毛竹PeGeBP 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果相符[6]，但不同于水稻OsGeBP蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果[4]。

2.3 GeBP 蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MEGA5 軟件對 9 個GmGeBP 蛋白和18 個擬南芥AtGeBP 蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。如圖2 所示，27 個GeBP 家族成員可分為5 個進(jìn)化枝，分別含有11 個（Ⅰ）、4 個（Ⅱ）、1 個（Ⅲ）、4 個（Ⅳ）和7 個（Ⅴ）GeBP 蛋白。進(jìn)化枝Ⅰ和Ⅳ為擬南芥和大豆共有，進(jìn)化枝Ⅱ和Ⅴ為擬南芥獨有，進(jìn)化枝Ⅲ為大豆獨有，且僅含有一個大豆GmGeBP4 蛋白。大豆GmGeBP 家族中存在3 組旁系同源蛋白（GmGeBP1 和GmGeBP7、GmGeBP3 和GmGeBP9、GmGeBP5 和GmGeBP6）。而大豆和擬南芥AtGeBP 家族之間不存在直系同源蛋白，說明GeBP 家族的分化晚于大豆和擬南芥物種的分化。親緣關(guān)系越近，可能意味著基因的功能越相似。進(jìn)化枝Ⅰ和進(jìn)化枝Ⅳ為擬南芥和大豆共有，因此這兩個進(jìn)化枝中的GeBP 基因很可能具有相似的生物學(xué)功能。

圖1 GmGeBP 保守結(jié)構(gòu)域分析

圖2 大豆和擬南芥GeBP 家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 GmGeBP 蛋白保守基序分析

蛋白保守基序預(yù)測結(jié)果顯示，9 個GmGeBP 中共存在15 個保守基序（圖3）。系統(tǒng)進(jìn)化樹中親緣關(guān)系越近的GmGeBP 蛋白所含有的保守基序分布也越相似。例如GmGeBP1 和GmGeBP7、GmGeBP3 和GmGeBP9、GmGeBP5 和GmGeBP6，所包含的保守基序在類型、數(shù)量和順序上非常相似。這也反映了GeBP 蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖3 大豆GmGeBP 蛋白保守基序

3 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定了9 個大豆GmGeBP 基因，并對基因及蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、染色體分布、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析，為后續(xù)GmGeBP 基因的功能研究提供參考和理論依據(jù)。