王利強(qiáng),姚風(fēng)芹,張俊河,崔月龍,周紹娟,陳瑞鋒,胡蓉蓉,劉文君

(1.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000；2.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院病案管理科，河南 安陽(yáng) 455000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院放療科，河南 安陽(yáng) 455000；5.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院體檢中心，河南 安陽(yáng) 455000；6.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院心內(nèi)科,河南 安陽(yáng) 455000；7.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科，河南 安陽(yáng) 455000)

腦梗死是指因腦部血液循環(huán)障礙所致的局限性腦組織缺血性壞死或軟化。腦梗死是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病,其防治意義重大。氯吡格雷是臨床上最常用的治療腦梗死和冠狀動(dòng)脈性心臟病的一種抗血小板聚集藥物，是治療和預(yù)防心腦血管疾病的一線藥物，然而由于個(gè)體差異大，很多患者在應(yīng)用氯吡格雷藥物后達(dá)不到預(yù)防和治療的效果，氯吡格雷對(duì)部分患者抗血小板作用缺乏或較低，稱為氯吡格雷抵抗[1-2]。發(fā)生氯吡格雷抵抗的原因主要與氯吡格雷藥物代謝酶基因CYP2C19的基因多態(tài)性有關(guān)[3-4]，漢族人群CYP2C19基因的主要突變類型是CYP2C19*2和CYP2C19*3。我國(guó)對(duì)CYP2C19基因檢測(cè)起步較晚，根據(jù)CYP2C19基因多態(tài)性可判斷不同的代謝型[5-6]，進(jìn)而判斷患者使用氯吡格雷藥物后對(duì)血小板聚集的抑制程度和敏感性，以達(dá)到治療心腦血管疾病和預(yù)防心腦血管疾病再發(fā)生的目的。不同CYP2C19基因代謝型與血小板聚集抑制率之間的關(guān)系爭(zhēng)議頗多，需要國(guó)內(nèi)學(xué)者不斷去驗(yàn)證。本研究旨在探討豫北地區(qū)漢族腦梗死患者CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的關(guān)系，以期為腦梗死患者臨床使用氯吡格雷藥物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院2018年6月至2019年12月收治的210例急性腦梗死患者為研究對(duì)象，其中男110例，女100例；年齡38.2～82.8(60.5±22.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病例來(lái)自豫北地區(qū)；(2)漢族；(3)根據(jù)《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為急性腦梗死；(4)血小板計(jì)數(shù)為(100～300)×109。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有腫瘤性疾病、糖尿病、血液性疾病或出血性疾病、傳染病史者；(2)有心臟、肝、腎等器官功能異常者；(3)入院前2個(gè)月未服用對(duì)氯吡格雷藥物作用有影響藥物者，如質(zhì)子泵抑制劑和甾體、非甾體藥物等。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 治療方法所有急性腦梗死患者于急性期使用尿激酶(南京南大藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10920040)溶栓治療24 h后，給予氯吡格雷(杭州賽諾菲制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130083)常規(guī)治療，每日75 mg，口服治療6 d后清晨抽取患者空腹靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸二鉀(ethylene dia mine tetraacetic acid dipotassium salt，EDTAK2)抗凝管，3 mL于枸櫞酸鈉抗凝管(枸櫞酸鈉與靜脈血按體積比1:9混合均勻)待用。

1.2.2 CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)取EDTAK2抗凝靜脈300 μL，采用熒光檢測(cè)儀(Flul tec 48E，西安天隆科技有限公司)和CYP2C19*2、CYP2C19*3熒光原位雜交檢測(cè)試劑盒(北京華夏時(shí)代科技有限公司)進(jìn)行熒光原位雜交以檢測(cè)所有患者的CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型。并根據(jù)的CYP2C19*2、CYP2C19*3的等位基因型(野生型GG、突變雜合型AG、突變純合型AA)組合判斷患者的CYP2C19基因代謝型(快代謝型、中間代謝型和慢代謝型)。儀器最終輸出6種CYP2C19*2、CYP2C19*3組合基因型，其中(GG，GG)為快代謝型基因，(GA,GG)、(GG,GA)為中間代謝型基因，(GA,GA)、(AA,GG)和(GG,AA)為慢代謝型基因[5-6]。

1.2.3 血栓彈力圖檢測(cè)患者靜脈血中二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)誘導(dǎo)血小板聚集抑制率和血栓形成的最大振幅(maximum amplitude,MA)值取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血1 mL，應(yīng)用血栓彈力圖凝血分析儀(GE5000，美國(guó)Haemoscope公司)和血栓彈力圖普通杯檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Haemoscope公司)檢測(cè)，讀取患者的ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率和MA值。氯吡格雷抵抗判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率≥30%為氯吡格雷非抵抗，ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率<30%為氯吡格雷抵抗。氯吡格雷抵抗發(fā)生率=氯吡格雷抵抗例數(shù)/總例數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 CYP2C19基因代謝型CYP2C19基因快代謝型、中間代謝型和慢代謝型患者分別有94、65、51例。

2.2 不同CYP2C19基因代謝型患者的ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率和MA值比較結(jié)果見表1。CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者的ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率顯著低于快代謝型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CYP2C19基因慢代謝型腦梗死患者的ADP聚集抑制率顯著低于中間代謝型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者的MA值顯著高于快代謝型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CYP2C19基因慢代謝型腦梗死患者的MA值顯著高于中間代謝型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同CYP2C19基因代謝型患者的ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率和MA值比較

2.3 不同CYP2C19基因代謝型患者的氯吡咯雷抵抗發(fā)生率比較CYP2C19基因快代謝型、中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者的氯吡咯雷抵抗發(fā)生率分別為30.85%(29/94)、47.69%(31/65)、68.63%(35/51)。CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者的氯吡咯雷抵抗發(fā)生率顯著高于快代謝型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.639、19.136，P<0.05)。CYP2C19基因慢代謝型腦梗死患者的氯吡咯雷抵抗發(fā)生率顯著高于中間代謝型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.107，P<0.05)。

2.4 腦梗死患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的危險(xiǎn)因素多元logistic回歸分析結(jié)果見表2。ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率和血栓彈力圖MA值是CYP2C19基因中間代謝型、慢代謝型腦梗死患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。

表2 腦梗死患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的危險(xiǎn)因素多元logistic回歸分析

3 討論

腦梗死是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，臨床防治腦梗死的意義重大，強(qiáng)調(diào)早預(yù)防、早診斷、早治療和早康復(fù)[7]。溶栓和抗血小板聚集治療是急性腦梗死的治療方案中2個(gè)重要步驟[7]，腦梗死患者常用的抗血小板聚集類藥物主要是氯吡格雷和阿司匹林等，氯吡格雷通過(guò)選擇性地抑制ADP與血小板受體的結(jié)合及抑制ADP介導(dǎo)的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物的活化來(lái)抑制血小板聚集[9]。經(jīng)過(guò)氯吡格雷治療后大部分急性腦梗死患者療效明顯,但仍有4%～30%的患者應(yīng)用氯吡格雷治療后療效欠佳，可能與氯吡格雷藥物代謝酶CYP2C19基因多態(tài)性有關(guān)[10]。氯吡格雷是一種前體藥物，經(jīng)腸道吸收后85%～90%酯化為無(wú)活性產(chǎn)物，僅10%～15%通過(guò)細(xì)胞色素P450代謝為活性產(chǎn)物，特別是藥物代謝酶CYP2C19對(duì)氯吡格雷的活化發(fā)揮重要作用[11]。CYP2C19基因根據(jù)CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17基因型組合判斷可分為4種，超快代謝型、快代謝型(正常代謝型)、中間代謝型和慢代謝型[12]。中國(guó)人群中超快代謝型突變頻率極低(主要與CYP2C19*17有關(guān))[5]，快代謝型、中間代謝型和慢代謝型在中國(guó)人群中突變頻率較高[5]，因此，本研究對(duì)CYP2C19基因快代謝型、中間代謝型、慢代謝型進(jìn)行了檢測(cè)分析。CYP2C19基因慢代謝型腦梗死患者的臨床預(yù)后較差，主要原因是此類患者體內(nèi)氯吡格雷活化代謝率下降，抑制血小板聚集不夠充分，缺血事件發(fā)生率較高[13-14]。

熒光原位雜交技術(shù)采用不同熒光素標(biāo)記的已知DNA序列探針，分別與目的基因反復(fù)雜交使熒光信號(hào)增強(qiáng)，并通過(guò)熒光顯微鏡或熒光檢測(cè)儀檢測(cè)目的基因是否存在,熒光檢測(cè)儀可通過(guò)熒光曲線區(qū)分目的基因的類型[15]。血栓彈力圖檢測(cè)結(jié)果能夠?yàn)榕R床醫(yī)師提供有效、準(zhǔn)確、客觀的凝血信息，在臨床指導(dǎo)心腦血管疾病患者抗血小板診治方面具有重要作用，并為后期個(gè)體化方案的選擇提供重要的信息[16]。本研究基于熒光原位雜交技術(shù)和血栓彈力圖技術(shù)，分別檢測(cè)了豫北地區(qū)漢族人群急性腦梗死患者的CYP2C19基因型和ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率及血栓彈力圖 MA值，研究CYP2C19基因多態(tài)性引起的不同代謝型與血小板聚集抑制率及發(fā)生氯吡格雷抵抗的關(guān)系。血栓彈力圖MA值表示血小板參與凝血塊形成的最終強(qiáng)度，其值高低反映了血小板聚集功能的強(qiáng)弱[16]。本研究結(jié)果顯示，CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者的ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率顯著低于快代謝型患者，慢代謝型腦梗死患者的ADP聚集抑制率顯著低于中間代謝型患者；CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者的MA值顯著高于快代謝型患者，CYP2C19基因慢代謝型腦梗死患者的MA值顯著高于中間代謝型患者。此外，多元logistic回歸分析顯示，ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率是CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17-18]。本研究多元logistic回歸分析顯示，血栓彈力圖MA值也是CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這可能是由于CYP2C19基因快代謝型腦梗死患者氯吡格雷活化代謝產(chǎn)物水平較高，抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集功能強(qiáng)，抑制血小板參與形成的凝血強(qiáng)度幅度較大，因此CYP2C19基因快代謝型腦梗死患者M(jìn)A值較低；CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者氯吡格雷活化代謝產(chǎn)物水平較低，抑制ADP介導(dǎo)的血小板聚集功能弱，抑制血小板參與形成的凝血強(qiáng)度幅度較小，因此CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者M(jìn)A值較高，并且中間代謝型低于慢代謝型。

腦梗死患者發(fā)生氯吡格雷抵抗可能是由于CYP2C19基因變異，主要是CYP2C19*2(rs4244285)和CYP2C19*3(rs4986893)腺嘌呤和鳥嘌呤的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)催化活性、無(wú)功能的CYP2C19蛋白片段[19]。CYP2C19*1是正常代謝酶的編碼基因[20]，攜帶 CYP2C19*2和 CYP2C19*3突變基因的個(gè)體對(duì)氯吡格雷的代謝水平較低，導(dǎo)致了氯吡格雷治療后的抵抗，原因可能是CYP2C19*2、CYP2C19*3等位基因突變，引起CYP2C19酶活性降低，雜合突變和純合突變引起酶活性降低程度不一，純合突變引起酶活性降低程度最低，因此不同CYP2C19基因代謝型抑制ADP與血小板受體的結(jié)合及抑制ADP介導(dǎo)的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物的活化不同，進(jìn)而引起抑制血小板聚集程度不同。本研究結(jié)果顯示，CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型患者的氯吡咯雷抵抗發(fā)生率顯著高于快代謝型腦梗死，CYP2C19基因慢代謝型腦梗死患者的氯吡咯雷抵抗發(fā)生率顯著高于中間代謝型；提示豫北地區(qū)漢族腦梗死患者CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型患者發(fā)生氯吡格雷抵抗率較高。CYP2C19基因快代謝型腦梗死患者，由于沒有發(fā)生CYP2C19基因變異，CYP2C19酶活性正常，因此，氯吡格雷抵抗發(fā)生率低；CYP2C19基因中間代謝型腦梗死患者CYP2C19*2、CYP2C19*3等位基因中一個(gè)發(fā)生了雜合突變，CYP2C19酶活性較低；CYP2C19基因慢代謝型腦梗死患者CYP2C19*2、CYP2C19*3等位基因中一個(gè)發(fā)生了純合突變或同時(shí)發(fā)生了雜合突變，CYP2C19代謝酶活性最低；因此CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者出現(xiàn)了較高的氯吡格雷抵抗發(fā)生率，并且CYP2C19基因中間代謝型氯吡格雷抵抗發(fā)生率低于慢代謝型，證實(shí)了上述結(jié)論。

BAUER等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因多態(tài)性與ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率及氯吡格雷抵抗發(fā)生率并不存在相關(guān)性；這可能是由于該研究主要基于過(guò)去文獻(xiàn)的Meta分析和隨訪預(yù)后分析認(rèn)為其不存在相關(guān)性，具有一定的局限性，與本研究實(shí)驗(yàn)分析方法不同，另外可能還有不同民族之間的遺傳性差異因素，因而存在不同的結(jié)論。

綜上所述，豫北地區(qū)漢族腦梗死患者CYP2C19基因中間代謝型和慢代謝型患者氯吡格雷抵抗發(fā)生率較高，ADP誘導(dǎo)血小板聚集抑制率和血栓彈力圖MA值是中間代謝型和慢代謝型腦梗死患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由于本研究選取樣本量較少，尚需要進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行論證。