徐敬樸，陶興隆，鄭麗亞

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050000)

酪氨酸酶又稱單酚氧化酶，是廣泛分布于不同生物體內(nèi)的一種多銅酶，在黑素合成和酶褐變過程中發(fā)揮著重要作用[1]。目前已有天然來源(真菌、細(xì)菌、植物)和合成來源的酪氨酸酶抑制劑被廣泛用于害蟲防治、果蔬保鮮、護(hù)膚美白及色素沉著性疾病的治療[2-3]，但即便是植物來源的酪氨酸酶抑制劑，也常常因?yàn)榇嬖谝恍┓€(wěn)定性及安全性的問題而限制其應(yīng)用，如熊果苷由于不穩(wěn)定，可分解為對骨髓有潛在毒性的含苯代謝物、曲酸，具有致癌性[4]；因此，研究安全、有效、穩(wěn)定性高的新型酪氨酸酶抑制劑仍是目前國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)和方向。很多傳統(tǒng)中草藥具有美白祛斑的功效[5]，這些中草藥中通常含有對酪氨酸酶活性具有抑制作用的成分，并且副作用較小，因此，從中藥材中篩選酪氨酸酶抑制劑并進(jìn)行研究成為較好的選擇。但由于中藥材成分復(fù)雜，活性物質(zhì)含量較低，干擾物質(zhì)較多，作用機(jī)制不明確，因此，如何快速高效地從中篩選出特異性的活性物質(zhì)仍然是現(xiàn)代藥物研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[6]。隨著科技的發(fā)展，一些新的高通量篩選技術(shù)被開發(fā)和廣泛應(yīng)用于中藥材中活性成分的篩選。酶抑制劑的體外篩選途徑主要有基于活性的直接篩選和基于親和作用的篩選。本文就可用于篩選中藥材中酪氨酸酶抑制劑的方法及其特點(diǎn)進(jìn)行綜述，旨在為中藥材中酪氨酸酶抑制劑的快速篩選提供技術(shù)參考。

1 活性篩選法

活性篩選是通過測定酶促反應(yīng)生成物或反應(yīng)物的變化來判斷待篩選物對酶的抑制效果[7]。酪氨酸酶底物如單酚類底物酪氨酸或雙酚類底物左旋多巴(levodopa，L-DOPA)可在酪氨酸酶的催化下生成多巴色素，多巴色素具有一定的吸光性，可通過測定吸光度來評估酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶抑制劑可抑制酪氨酸酶的活性，從而減少多巴色素的生成，因此，根據(jù)多巴色素含量的多少可評估酪氨酸酶的活性，從而推算出待測物對酪氨酸酶的抑制率[8]。

1.1 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀直接測定吸光度進(jìn)行酪氨酸酶抑制劑篩選的方法運(yùn)用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀直接測定吸光度進(jìn)行酪氨酸酶抑制劑篩選的方法是指直接將待測物與酪氨酸酶底物在酪氨酸酶的催化下進(jìn)行反應(yīng)，通過分光光度劑或酶標(biāo)儀測定多巴色素吸光度的改變來評估待測物對酪氨酸酶的抑制能力，由于該方法操作簡單，因此廣泛用于中藥提取物中酪氨酸酶抑制劑的初步篩選或已知成分對酪氨酸酶抑制能力的驗(yàn)證。

胡念芳等[9]采用分光光度計(jì)測定法研究了31種中草藥提取物在200～400 nm處的紫外吸收情況，篩選出前7位紫外吸收較強(qiáng)的植物提取物，并應(yīng)用α,α-二苯基-β-苦味肼(α,α-diphenyl-β-picryhydrazyl，DPPH)法篩選出4種清除DPPH自由基作用較強(qiáng)的物質(zhì)，然后采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法，以維生素C為對照，驗(yàn)證了4種物質(zhì)對酪氨酸酶的抑制作用，最終篩選出大黃、槐米、黃芩、檀香提取物4種具有廣譜吸收性能、較強(qiáng)抗氧化能力及一定美白功效的植物防曬劑。穆丹丹等[10]采用酪氨酸酶催化氧化L-DOPA速率法研究了15種中藥的活性成分對酪氨酸酶的抑制作用，最終篩選出槲皮素、豆蔻明2種天然高效的具有酪氨酸酶抑制作用的活性成分。該方法還被用于七子美白成分、阿膠多糖、槐米、大黃、無患子等物質(zhì)對酪氨酸酶抑制作用的研究[11-17]。

應(yīng)用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀直接測定吸光度篩選酪氨酸酶抑制劑的不足之處在于其僅能判斷待測物是否具有抑制酪氨酸酶活性的能力，當(dāng)待測物的成分復(fù)雜時無法檢測出究竟是哪一種成分具有抑制酪氨酸酶活性的能力；而且有些植物的粗提物雖然能表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制酪氨酸酶活性的能力，但無法經(jīng)過傳統(tǒng)的精制過程得到高活性的單體。因此，越來越多的研究人員開始采用目標(biāo)明確、操作簡單、篩選效率高的親和篩選法。

1.2 高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)-譜效關(guān)系篩選法中藥譜效學(xué)是指將中藥指紋圖譜與藥效學(xué)方法結(jié)合起來，其不但能標(biāo)示出中藥中含有的多種成分，還能很好地揭示出這些成分與藥效之間的關(guān)系[18]。該方法常用于闡明中藥中各種成分對藥效的貢獻(xiàn)程度，主要方法包括偏最小二乘回歸分析法、多元線性回歸分析法等[19]。

孫慧玲等[20]取不同采收時期的紫荊葉樣品16批，采用偏最小二乘回歸分析法，根據(jù)紫荊葉提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用，考察其特征圖譜所代表的不同成分對該抑制作用的貢獻(xiàn)程度，以期為篩選具有抑制酪氨酸酶活性作用的天然美白原料提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)，該實(shí)驗(yàn)最終篩選出6個與對酪氨酸酶的抑制作用呈正相關(guān)的共有峰和2個呈負(fù)相關(guān)的共有峰。

采用HPLC-譜效關(guān)系進(jìn)行酪氨酸酶抑制劑篩選的方法得到的共有峰的峰面積與酪氨酸酶活性的相關(guān)性只能表示其作用趨勢，并不能表明這些化合物對酪氨酸酶的活性起到抑制或激活作用，而且譜效關(guān)系分析的前體是以各個峰作為獨(dú)立樣本進(jìn)行分析，忽略了不同化合物之間可能存在的相互作用。因此，得到的色譜峰所代表的化合物的結(jié)構(gòu)及對酪氨酸酶的抑制作用仍需進(jìn)一步鑒定。

1.3 高效薄層色譜法(high performance thin layer chromatography，HPTLC)自動分析篩選法HPTLC自動檢測技術(shù)是將被分離的化合物固定在固相二氧化硅上，通過直接偶聯(lián)薄層色譜板上的可視酶反應(yīng)而進(jìn)行的活性篩選[21]。該方法將色譜分離的優(yōu)點(diǎn)與活性評估相結(jié)合，為復(fù)雜植物提取物的化學(xué)和生物篩選提供了一種簡單、快速的方法[22]。

REVOLTELLA等[22]用2種不同溶劑對133種歐洲植物的花、根、葉或果實(shí)進(jìn)行提取，得到476份提取物，并采用HPTLC自動分析法對其進(jìn)行了酪氨酸酶抑制作用的研究。該實(shí)驗(yàn)以曲酸作為陽性對照，分別在HPTLC板的前、后位置進(jìn)行對照，展開劑展開并用氨水中和后，所有平板均衍生化，先用底物溶液L-DOPA噴灑，由于酪氨酸被氧化成相應(yīng)的多巴基酮，而酪氨酸酶抑制劑在深色背景下顯示白色斑點(diǎn)[23]，最終篩選出鐵角蕨、鉤狀松亞種、黃芩3種具有較好的抑制酪氨酸酶活性的植物。

HPTLC自動分析法用于大量樣本中酪氨酸酶抑制劑的篩選具有簡單、快速的優(yōu)點(diǎn)，但仍不能確定具體為何種成分具有抑制能力，因此，目前主要用于復(fù)雜成分的初步篩選。

1.4 HPLC聯(lián)合液質(zhì)聯(lián)用儀(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)篩選法HPLC能夠快速分離得到純度高且保持活性的產(chǎn)物，經(jīng)過分離得到的物質(zhì)經(jīng)活性測定后，再經(jīng)LC-MS快速鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而可篩選出能夠抑制酪氨酸酶活性的物質(zhì)，該方法也越來越多地被用于酪氨酸酶抑制劑的篩選。

邢珍珍等[24]采用HPLC聯(lián)合LC-MS對甘草甜味素中抑制酪氨酸酶活性的物質(zhì)進(jìn)行了篩選。甘草甜味素經(jīng)HPLC 色譜柱分離后，利用二極管陣列(photo-diode array,PDA)檢測器得到各活性組分的紫外光譜圖，接取流出液在96孔板中與酪氨酸酶、L-DOPA作用，利用酶標(biāo)儀檢測酶剩余活力，從而實(shí)現(xiàn)篩選的目的，然后利用PDA檢測器及串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定，最終從甘草甜素中共鑒定出4個明顯具有抑制酪氨酸酶活性的化合物，分別為甘草苷、18α-羥基甘草次酸甲酯、甘草查耳酮 C、18α-甘草次酸。

由于HPLC聯(lián)合LC-MS進(jìn)行篩選的方法需采用脫機(jī)、非在線的色譜聯(lián)用技術(shù)，樣品在處理過程中容易發(fā)生污染、變質(zhì)和損失，因此,這也成為限制其應(yīng)用的主要弊端。

2 親和篩選法

親和篩選是用質(zhì)譜及相關(guān)技術(shù)測定抑制劑與酶的結(jié)合情況來評價酶活性,從而進(jìn)行酶抑制劑的篩選[7]。藥物發(fā)揮作用的第一步是與生物大分子(如受體、酶、脫氧核糖核酸、核糖核酸等)的親和[25]，基于親和作用的篩選方法是一種利用大分子靶標(biāo)與配體結(jié)合的原理，從復(fù)雜混合物中分離潛在配體的極為方便有效的方法[26]，例如，將靶分子親和技術(shù)與質(zhì)譜檢測技術(shù)聯(lián)合的靶分子親和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的篩選。此類方法具有高效、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[27]。目前已報道的可用于酪氨酸酶抑制劑篩選的技術(shù)有超濾-LC-MS技術(shù)、中空纖維固定-LC-MS技術(shù)、渦流色譜-LC-MS技術(shù)、基于HPLC的柱后衍生技術(shù)、固定化酶微反應(yīng)器-毛細(xì)管電泳法。

2.1 超濾-LC-MS技術(shù)篩選法超濾-LC-MS技術(shù)是利用超濾膜的分子篩作用，通過超濾離心法對靶蛋白、靶蛋白與活性小分子的結(jié)合物以及未結(jié)合的小分子物質(zhì)進(jìn)行分離，利用結(jié)合前后小分子物質(zhì)峰面積的減少進(jìn)行分析來辨別活性成分。該方法是親和篩選法中最為常用的一種方法[27]。

YIN等[28]以白藜蘆醇為陽性對照，采用超濾-HPLC-PDA檢測器-LC-MS技術(shù)和分子對接技術(shù)對木蝴蝶中潛在的酪氨酸酶抑制劑進(jìn)行了篩選和鑒定，最終鑒定出7種與酪氨酸酶有結(jié)合親和力的化合物，其中黃芩素和木蝴蝶苷A 2種化合物顯示出對酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制作用。LIU[29]等以熊果酸為陽性對照，采用親和超濾-LC-MS技術(shù)對葛根提取物中的酪氨酸酶抑制劑進(jìn)行篩選，最終篩選出葛根素、葛根素芹菜糖苷、黃豆苷和genistinc 4種潛在的酪氨酸酶抑制劑，經(jīng)過驗(yàn)證，葛根素、葛根素芹菜糖苷對酪氨酸酶具有較強(qiáng)的抑制作用。張鴿[30]采用離心超濾質(zhì)譜技術(shù)分別從中藥白附子和葛根中篩選出5種和7種酪氨酸酶抑制劑。

超濾-LC-MS技術(shù)能對復(fù)雜中藥樣品中具有靶酶親和作用的成分進(jìn)行快速篩選，具有靈敏度高、分析速度快、樣品用量少、高通量以及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但存在因非特異性結(jié)合而出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能。

2.2 中空纖維固定-LC-MS技術(shù)篩選法中空纖維離心超濾裝置由一根折成U形的中空纖維和玻璃試管組成，在離心過程中，待測樣品通過中空纖維內(nèi)外進(jìn)行遷移運(yùn)動[31]，以達(dá)到對樣品分離純化的目的。

段坤峰等[32]采用中空纖維固定化酪氨酸酶法特異性篩選了北沙參中可抑制酪氨酸酶活性的成分，該實(shí)驗(yàn)采用物理吸附法把靶蛋白固定在聚丙烯中空纖維中，與樣品溶液一起孵育后，將作用前后的色譜圖進(jìn)行對比，篩選出具有靶酶親和作用的5個成分，并用對照品對其中3個成分(花椒毒素、補(bǔ)骨脂素和氧化前胡素)進(jìn)行鑒定和活性驗(yàn)證,結(jié)果顯示，這3種成分均有一定的抑制酪氨酸酶活性的能力，而且該方法與超濾法相比，具有酶用量少、成本低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。ZHAO等[33]同樣采用中空纖維固定化酪氨酸酶法從葛根提取物中篩選出7個潛在的酪氨酸酶抑制劑，并通過LC-MS技術(shù)初步鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，然后對其中的4個化合物進(jìn)行了體外活性驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷和葛根素芹菜糖苷3個化合物均具有較好的抑制酪氨酸酶活性的能力。

2.3 渦流色譜-LC-MS技術(shù)篩選法渦流色譜柱是采用大粒徑填料填充的一種色譜柱，具有液相色譜和分子排阻色譜的雙重特性。流動相在高流速下可產(chǎn)生渦流狀態(tài)，大分子的基質(zhì)成分如蛋白質(zhì)等還未能擴(kuò)散進(jìn)入填料孔隙就被快速洗脫，而小分子物質(zhì)可得以保留[27]，從而起到分離大分子與小分子物質(zhì)的目的。

徐敬樸等[34]采用渦流色譜-LC-MS技術(shù)對可藥食兩用的葛根中潛在的酪氨酸酶抑制劑進(jìn)行篩選，具體方法：葛根提取物與酪氨酸酶共同孵育后，經(jīng)渦流色譜柱分離，然后收集大分子流出物(靶酶-配體復(fù)合物)，采用甲醇沉淀蛋白的方式將與酪氨酸酶結(jié)合的物質(zhì)進(jìn)行解離，解離液經(jīng)LC-MS定性分析，最終篩選出3種可與酪氨酸酶結(jié)合的組分，并以篩選出的葛根素為代表對其抑制酪氨酸酶活性的能力進(jìn)行了驗(yàn)證。

渦流色譜具有能快速實(shí)現(xiàn)對大小分子的分離、不影響靶標(biāo)-分子結(jié)合的動態(tài)平衡等特點(diǎn)，且與超濾法相比具有較小的非特異性結(jié)合的優(yōu)勢。

2.4 基于HPLC的柱后衍生技術(shù)篩選法基于HPLC的柱后衍生技術(shù)是通過將混合樣品注入HPLC后在選定的色譜條件下進(jìn)行分離，各組分從色譜柱流出后，先后與衍生化試劑在一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，生成衍生產(chǎn)物，再依次進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測。柱后衍生技術(shù)是分析化學(xué)中常用的一種在線處理技術(shù)，該方法可不改變被分離物的色譜行為，并可使化合物的分離、鑒定和活性評價有機(jī)結(jié)合，一次進(jìn)樣即可同時獲得化合物的化學(xué)和生物活性信息。

羅碧[35]建立了一種基于HPLC的柱后衍生法用于薰衣草花提取物中酪氨酸酶抑制劑的快速篩選，具體方法是在優(yōu)化好條件后，先用已知的強(qiáng)效酪氨酸酶抑制劑對該系統(tǒng)進(jìn)行可靠性驗(yàn)證，然后運(yùn)用該系統(tǒng)從薰衣草花提取物中發(fā)現(xiàn)了3種可抑制酪氨酸酶活性的成分，并經(jīng)分離純化確定了其中一種化合物為5-羥甲基-糠醛。王立軍[36]同樣利用HPLC柱后衍生技術(shù)對白芍、桑白皮提取物中的活性成分進(jìn)行在線篩選，得到了沒食子酸等6種酪氨酸酶抑制劑。

與已有的在線篩選方法相比，基于HPLC的柱后衍生法具有省時、省力、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但由于該方法需針對不同的藥物靶標(biāo)開發(fā)出專屬、靈敏、穩(wěn)定的在線酶活性檢測方法，因此該方法并不適用于所有藥物；而且該法需要將靶標(biāo)持續(xù)泵入分析系統(tǒng)，成本較高。

2.5 固定化酶微反應(yīng)器-毛細(xì)管電泳篩選法對酶抑制劑進(jìn)行篩選的毛細(xì)管電泳主要有2種模式：(1)酶反應(yīng)脫機(jī)進(jìn)行的毛細(xì)管前酶分析；(2)將取樣、反應(yīng)、分離、檢測集成在單個毛細(xì)管中的毛細(xì)管內(nèi)酶分析法。毛細(xì)管內(nèi)酶分析法包括電泳介導(dǎo)微分析和固定化酶微反應(yīng)器2種方式，實(shí)現(xiàn)了自動操作，降低了樣品和溶液的消耗[37]。以固定化酶作為催化劑進(jìn)行酶促反應(yīng)的裝置稱為固定化酶反應(yīng)器，固定化酶是通過物理或化學(xué)的方法，將酶束縛于水不溶性的載體或一定的空間內(nèi)，限制了酶分子的自由流動，但是酶能充分發(fā)揮其催化作用[38]。在線固定化酶微反應(yīng)器具有分析時間快、樣品操作次數(shù)少、可重復(fù)使用和延長酶的貯存時間等優(yōu)點(diǎn)。

CHENG等[39]建立了一種利用在線固定化酶微反應(yīng)器-毛細(xì)管電泳技術(shù)從中藥材中篩選酪氨酸酶抑制劑的新方法，并通過分子對接技術(shù)研究了酶與抑制劑之間的分子相互作用。為了縮短分析時間，提高篩選效率，該研究在毛細(xì)管電泳中采用了短端進(jìn)樣工藝，從毛細(xì)管出口端依次進(jìn)行基質(zhì)(L-DOPA)和產(chǎn)物的采樣、酶反應(yīng)、分離和檢測，并用已知的酪氨酸酶抑制劑曲酸對該方法進(jìn)行了驗(yàn)證，最終從15種中藥材中發(fā)現(xiàn)槲皮素、山奈酚、巴伐其素和巴枯酚4種具有酪氨酸酶抑制作用的成分。該方法具有樣品消耗少、實(shí)驗(yàn)成本低、操作自動化、分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，有利于進(jìn)行酪氨酸酶抑制劑的高通量篩選。

3 結(jié)語

中藥成分復(fù)雜多樣，開發(fā)出切實(shí)可行的活性成分快速識別方法并將識別到的活性成分提取純化用于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究以使更多的患者獲益，是現(xiàn)代中藥研究與開發(fā)的關(guān)鍵。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的新技術(shù)被用于中藥等復(fù)雜體系中活性成分的篩選。除本文中總結(jié)的技術(shù)外，分子排阻色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、限制介入-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等均可用于中藥等復(fù)雜體系中活性成分的快速篩選，或許也可應(yīng)用于酪氨酸酶抑制劑的篩選。為了加快酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)程，希望未來有更多高效率、低成本、操作簡單的方法能得到開發(fā)和應(yīng)用。