李 燁，賀峻祎，祁明美，張友忠，郝春燕**，崔保霞

(1.山東大學齊魯醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科;b.病理科，濟南 250012；2.莒縣人民醫(yī)院病理科，莒縣 276522)

妊娠滋養(yǎng)細胞疾病是一組臨床上較為罕見的妊娠相關性疾病。葡萄胎(hydatidiform mole，HM)為最常見的妊娠滋養(yǎng)細胞疾病，其典型病理組織學特征為不同程度的滋養(yǎng)細胞增生和胎盤絨毛水腫[1-4]。根據(jù)病理形態(tài)、遺傳和臨床特征，HM又分為完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole，CHM)和部分性葡萄胎(partial hydatidiform mole，PHM)。水腫性流產(chǎn)(hydropic abortion，HA)是一種在組織形態(tài)學表現(xiàn)上類似于HM的非葡萄胎異常妊娠。CHM進展為妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤(gestational trophoblastic neoplasia，GTN)的風險約為15%～20%，PHM進展為GTN的風險約為0.5%～5%[4]，HA繼發(fā)惡變的情況極為罕見，風險約為0.0002%。由于CHM、PHM和HA的臨床管理及預后不同，在臨床實踐當中準確地鑒別三者非常重要。隨著超聲診斷技術的不斷提高及血HCG值的監(jiān)測，孕周較早的葡萄胎妊娠能夠及時得以清宮處理。但是對于早孕期的組織樣本，由于形態(tài)學上的重疊，單純依靠病理組織學檢查并不能完全區(qū)分CHM、PHM、HA這三種病變類型[5]。細胞遺傳學發(fā)現(xiàn)分子基因分型技術對于鑒別三者具有重要意義，但是由于經(jīng)濟和技術等方面的原因，使得該方法在臨床使用受限。因此，臨床上需要一種快速、簡便、低價的檢測手段對葡萄胎各亞型之間、葡萄胎與水腫性流產(chǎn)之間進行精準鑒別。本研究旨在通過免疫組化染色檢測Bcl-2、p63、Ki-67蛋白在CHM、PHM和HA中的表達情況，以評價它們在鑒別妊娠早期的CHM、PHM和HA中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集山東大學齊魯醫(yī)院病理科2012年1月至2018年6月的妊娠早期(<14周)CHM、PHM與HA樣本共139例。由兩位病理科醫(yī)生分別對139例樣本重新閱片，剔除形態(tài)學存在爭議的樣本14例，得到病理組織學診斷結(jié)果一致的樣本125例。對125例樣本行p57免疫組化染色,最后篩選出p57陰性的CHM 55例，p57陽性的PHM 29例，p57陽性的HA 40例，剔除1例p57陰性的HA。將最后篩選出的CHM、PHM及HA樣本作為三個實驗組。

1.2 主要試劑 鼠單克隆抗體Ki-67(1∶100稀釋，UMAB107)、鼠單克隆抗體抗p57kip2(即用型，Kp10)、通用二步法檢測試劑盒(PV9000)、DAB底物液(ZLI-9018)及EDTA抗原修復液(ZIL-9067)購自北京中杉金橋公司。兔單克隆抗體抗Bcl-2(即用型，SP66)與鼠單克隆抗體抗p63(即用型，4A4)購美國文塔納醫(yī)療系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 采用免疫組化PV二步法。組織蠟塊3μm厚連續(xù)切片，將切片置于60℃恒溫箱中烘烤2h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，置于EDTA抗原修復液(pH 8.0，1∶49稀釋)高溫高壓修復抗原3min，自然冷卻至室溫。滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫放置10min，滴加一抗4℃孵育過夜，PBS代替一抗作為陰性對照。復溫后，滴加反應增強液37℃孵育30min，滴加二抗37℃孵育30min。DAB顯色7～8min，蘇木素復染，酒精梯度脫水、透明、封片。

1.3.2 結(jié)果評分 免疫組化染色結(jié)果由兩位醫(yī)師交叉雙盲判定。p57絨毛間質(zhì)細胞和細胞滋養(yǎng)細胞陽性細胞百分比>10%為陽性,≤10%為陰性。Ki-67與p63選取絨毛細胞滋養(yǎng)細胞著色最密集的部分，高倍鏡(×400)計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計陽性細胞百分比(陽性著色細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù))。Bcl-2采用免疫反應積分(immunoreactivity score，IRS)來評分，即著色強度和陽性細胞百分比的乘積。陽性細胞百分比評分：高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野，陽性細胞百分比<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。著色強度評分：不著色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、深褐色為3分。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS23.0軟件，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，三組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗及Bonferroni校正。受試者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲線用于分析3種蛋白在不同實驗組鑒別診斷的預測價值。對PHM與HA組p63、Ki-67蛋白表達情況行逐步logistic回歸分析，兩模型ROC曲線下面積的比較采用Mann-Whitney法。數(shù)據(jù)均為雙側(cè)檢驗，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 p57、Ki-67、p63、Bcl-2蛋白表達情況

2.1.1 p57表達 p57主要表達于絨毛細胞滋養(yǎng)細胞、絨毛間質(zhì)細胞和中間型滋養(yǎng)細胞的細胞核，合體滋養(yǎng)細胞的細胞核不表達。p57在PHM與HA的絨毛細胞滋養(yǎng)細胞和間質(zhì)細胞中彌漫性表達，而在CHM的絨毛細胞滋養(yǎng)細胞和間質(zhì)細胞中不表達或極少量表達(圖1A～B)。

2.1.2 Ki-67表達 Ki-67主要表達于細胞滋養(yǎng)層細胞及中間型滋養(yǎng)細胞的細胞核，合體滋養(yǎng)層細胞及間質(zhì)細胞的細胞核極少量表達(圖1C～D)。Ki-67在HA、PHM、CHM組中的表達比較，差異顯著(P<0.05)。CHM組中Ki-67蛋白表達顯著高于PHM組(P<0.017),PHM組中Ki-67蛋白表達顯著高于HA組(P<0.017)。見表1。

2.1.3 p63表達 p63主要表達于絨毛細胞滋養(yǎng)細胞的細胞核(圖1E～F)，p63蛋白在HA、PHM、CHM組中的表達比較，差異顯著(P<0.05)。HA組中p63蛋白表達顯著高于PHM(P<0.017),而PHM與CHM組中p63蛋白表達無顯著差異(P>0.017)。見表1。

表1 Ki-67、p63、Bcl-2蛋白在CHM、PHM及HA中的表達

2.1.4 Bcl-2表達 Bcl-2主要表達于所有的合體滋養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)，絨毛間質(zhì)細胞及蛻膜細胞不著色(圖1G～H)。Bcl-2蛋白在HA、PHM、CHM組中的表達差異顯著(P<0.05)。Bcl-2蛋白在HA組的表達顯著高于PHM組(P<0.017)，而在CHM與PHM組的表達無顯著差異(P>0.017)。見表1。

2.2 ROC曲線分析

2.2.1 Ki-67用于鑒別CHM與PHM、PHM與HA的ROC曲線分析 ROC曲線分析Ki-67鑒別CHM與PHM的預測價值，Ki-67陽性百分比68.5%為最佳截斷值，Ki-67陽性百分比>68.5%診斷CHM，AUC為0.666，95%置信區(qū)間0.533～0.799，敏感度為87.3%，特異性為55.2%，PPV 78.7%，NPV 69.6%，診斷的準確性較低。ROC曲線分析Ki-67鑒別PHM與HA的預測價值，Ki-67陽性百分比48.5%為最佳截斷值，Ki-67陽性百分比<48.5%診斷HA，AUC為0.757，95%置信區(qū)間為0.626～0.888，敏感度為82.5%，特異性為72.4%，PPV 80.5%，NPV 75.0%，診斷具有一定的準確性。見圖2。

2.2.2 p63用于鑒別PHM與HA的ROC曲線分析 ROC曲線分析p63鑒別PHM與HA的預測價值，p63陽性百分比為83.5%為最佳截斷值，p63陽性百分比>83.5%診斷HA，AUC為0.898，95%置信區(qū)間為0.820～0.976，敏感度為95.0%，特異性為79.3%，PPV 86.4%，NPV 92.0%，診斷具有一定的準確性。見圖2。

2.2.3 Bcl-2用于鑒別PHM與HA的ROC曲線分析 ROC曲線分析Bcl-2鑒別PHM與HA的預測價值，Bcl-2的IRS=8.5為最佳截斷值，IRS>8.5診斷HA，AUC為0.680，95%置信區(qū)間為0.552～0.808，敏感度為45.0%，特異性為82.8%，PPV 78.3%，NPV52.2%，診斷的準確性較低。見圖2。

2.2.4 Ki-67聯(lián)合p63用于鑒別PHM與HA的ROC曲線分析 采用逐步logistic回歸分析構(gòu)建Ki-67聯(lián)合p63鑒別PHM與HA的預測模型，同時獲得該模型的相關預測概率。ROC曲線進一步分析此預測概率用于鑒別PHM與HA的預測價值，得到AUC為0.934，95%置信區(qū)間為0.868～0.999，敏感度為95.0%，特異性為79.3%，PPV 86.4%，NPV 92.0%，診斷的準確性較高。Ki-67聯(lián)合p63用于鑒別PHM與HA的AUC(0.934)顯著高于單獨p63鑒別PHM與HA的AUC(0.898)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 ROC曲線A：Ki-67在鑒別CHM與PHM的ROC曲線；B：Ki-67、p63及bcl-2分別在鑒別PHM與HA的ROC曲線；C：p63聯(lián)合Ki-67與單獨p63分別在鑒別PHM與HA的ROC曲線

3 討 論

3.1 p57輔助診斷完全性葡萄胎 p57具有印記基因的遺傳特征，通常情況下為父源性等位基因被印跡，母源性等位基因得以表達。由遺傳學可知，CHM的基因組主要來自于父方，通常是由1個空卵受精形成的雙雄二倍體(46，XX或46,XY)。PHM的基因組來源于雙親，通常是由1個卵子和2個精子同時受精形成的孤雌雙雄三倍體(69，XXX，69，XXY，69，XYY)。HA的基因組來源于雙親，是由1個精子和1個卵子受精形成的正常二倍體(46，XX或46，XY)。由于CHM不含母源性染色體成分，p57蛋白不表達，而PHM與HA的基因組均含母源性染色體成分，p57蛋白陽性表達。因此，p57免疫組化染色可輔助診斷CHM[6]，但是不能鑒別PHM與HA。

3.2 Ki-67在葡萄胎診斷中的研究 Ki-67基因參與了滋養(yǎng)細胞分化的調(diào)控，其表達的產(chǎn)物Ki-67蛋白是一種反應組織細胞增生程度的極佳標志物。有文獻報道Ki-67在CHM、PHM與HA的表達情況，但并未得出一致結(jié)論。Moussa等[7]在運用p57染色與DNA倍體分析準確診斷CHM、PHM、HA的基礎上，對這三組樣本進行Ki-67染色，發(fā)現(xiàn)Ki-67蛋白在HA、PHM與CHM中表達逐漸增加，CHM表達顯著高于PHM，PHM表達顯著高于HA。本研究與Moussa等的研究結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)Ki-67抗原主要免疫定位于細胞滋養(yǎng)細胞的細胞核，CHM組中的Ki-67表達顯著高于PHM組(P<0.017)，PHM組顯著高于HA組(P<0.017)，診斷PHM與HA的ROC曲線下面積為0.757，具有一定的準確性。Khooei等[8]研究也證實了上述結(jié)論。但是，一項大樣本分析[1]發(fā)現(xiàn)，Ki-67蛋白在HA、PHM與CHM中表達逐漸增加，但CHM與PHM之間，PHM與HA之間無明顯統(tǒng)計學差異，不認為Ki-67能鑒別診斷PHM與HA。

3.3 p63在葡萄胎診斷中的研究 p63在葡萄胎妊娠中的具體作用機制，目前還不十分清楚，國內(nèi)外已有一些文獻研究p63在CHM、PHM與HA鑒別診斷中的作用，但是尚未得出一致結(jié)論。Ramalho等[9]和Masood等[10]通過p63免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)細胞滋養(yǎng)細胞的p63著色強度在HM組顯著高于HA組，差異有統(tǒng)計學意義，故認為p63可作為鑒別HM與HA的輔助診斷方法。Chen等[11]報道，PHM和HA的p63免疫表達結(jié)果無顯著差異。Heidarpour等[3]研究發(fā)現(xiàn)，p63的核免疫反應性在葡萄胎妊娠高于非葡萄胎妊娠，在PHM組高于CHM組，但是對于上述鑒別診斷的進一步ROC分析結(jié)果卻具有低的敏感度和特異性，因此并不推薦單獨使用p63來鑒別HM與HA。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p63在HA組大部分為極高表達，僅有1例樣本為中等程度表達，表達顯著高于葡萄胎妊娠組(P<0.017)。本研究結(jié)果顯示，PHM中p63蛋白表達高于CHM，但無顯著差異(P>0.017)。進一步ROC曲線分析p63在診斷PHM與HA的預測價值，得到AUC為0.898，敏感度為95.0%，特異性為79.3%，PPV 86.4%，NPV 92.0%，診斷具有一定的準確性。因此推薦使用p63作為輔助鑒別PHM與HA的方法之一。

3.4 Bcl-2在葡萄胎診斷中的研究 Bcl-2基因通過抑制細胞程序性凋亡而緊密參與了胎盤穩(wěn)態(tài)、生長、重塑等過程。Erol等[2]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在HA、PHM和CHM中的表達逐漸減少，HA組Bcl-2表達顯著高于PHM組，PHM組顯著高于CHM組。因此，Erol等認為Bcl-2可作為一種相對可靠、經(jīng)濟且高效的輔助診斷方法來鑒別CHM、PHM和HA。但最近一項大樣本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在HA、PHM與CHM中的表達逐漸增加，與Erol等結(jié)果完全相反[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白在HA、PHM與CHM的絨毛合體滋養(yǎng)細胞胞質(zhì)中表達逐漸減少；Bcl-2蛋白的表達在PHM與HA之間差異顯著(P<0.017)，但在CHM與PHM組之間無顯著差異(P>0.017)。進一步的ROC曲線分析Bcl-2在鑒別PHM與HA中的預測價值，AUC為0.680，診斷的準確性較低。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白在3組的合體滋養(yǎng)細胞中幾乎均呈陽性表達，3組的Bcl-2表達陽性細胞百分比無明顯差別(P>0.05)，差別主要表現(xiàn)在Bcl-2著色強度不同(P<0.05)?？紤]到僅憑Bcl-2著色強度差異輔助鑒別PHM與HA，受觀察者的主觀影響較大，并且Bcl-2用于診斷的準確性較低，所以不推薦使用Bcl-2來鑒別診斷PHM與HA。

3.5 p63聯(lián)合Ki-67對于PHM與HA的鑒別診斷價值 在臨床實踐當中，對于PHM與HA的診斷，除了分子基因分型之外，目前尚無較為特異的輔助鑒別方法，仍需進一步探究。本研究結(jié)果顯示，Ki-67、p63用于鑒別PHM與HA具有一定的準確性，而Bcl-2用于鑒別PHM與HA的準確性較低，臨床應用價值有限。本結(jié)果表明，相比于Ki-67染色，p63染色能以更高的準確性將PHM與HA鑒別開(p63/Ki-67的AUC、敏感度、特異性、PPV、NPV分別為：0.898/0.757，95.0%/82.5%，79.3%/72.4%，86.4%/80.5%，92.0%/75.0%)；聯(lián)合Ki-67與p63染色組與單獨p63染色組在敏感度、特異性、PPV及NPV方面結(jié)果完全相同，但是Ki-67聯(lián)合p63組的AUC(0.934)顯著高于單獨p63組的AUC(0.898),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，對于PHM與HA的鑒別診斷，聯(lián)合使用Ki-67與p63比單獨使用p63或單獨使用Ki-67具有更高的準確性及應用價值。

綜上所述，在無分子基因檢測設備或患者因價格昂貴、耗時等原因不愿意接受分子基因檢測情況下，對于葡萄胎妊娠與水腫性流產(chǎn)的診斷，臨床上可結(jié)合病理形態(tài)學表現(xiàn)與p57免疫組化染色輔助診斷CHM，同時加用Ki-67與p63免疫染色輔助鑒別PHM與HA。